[發(fā)明專利]工程化的CRISPR-Cas9核酸酶

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680063266.8
• 申請(qǐng)日: 2016-08-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108350449B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: J·K·喬昂格;B·克萊因斯蒂弗;V·派特塔那雅克
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 通用醫(yī)療公司
• 主分類號(hào): C12N9/22
• 分類號(hào): C12N9/22;C12N15/113
• 代理公司: 北京林達(dá)劉知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

1.一種分離的釀膿鏈球菌Cas9(SpCas9)蛋白，該蛋白的氨基酸序列為在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中具有Q695A和Q926A兩個(gè)突變，并且該蛋白任選地包含核定位序列、細(xì)胞穿透肽序列、和/或親和標(biāo)簽中的一種或多種。

2.如權(quán)利要求1所述的分離的蛋白，其包含以下全部四個(gè)位置處的突變：N497A、R661A、Q695A、和Q926A。

3.如權(quán)利要求2所述的分離的蛋白，其進(jìn)一步包含在L169A、Y450A和D1135A位置處的一個(gè)、兩個(gè)或全部三個(gè)位置處的突變。

4.如權(quán)利要求1所述的分離的蛋白，其進(jìn)一步包含在L169A、Y450A、N497A、R661A和D1135A位置處的一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或全部五個(gè)位置處的突變。

5.如權(quán)利要求1所述的分離的蛋白，其進(jìn)一步包含以下突變中的一個(gè)或多個(gè)：D1135E；D1135V；D1135V/R1335Q/T1337R；D1135E/R1335Q/T1337R；D1135V/G1218R/R1335Q/T1337R；或

D1135V/G1218R/R1335E/T1337R。

6.如權(quán)利要求1所述的分離的蛋白，其還包含降低核酸酶活性的選自下組的一個(gè)或多個(gè)突變，該組由以下組成：在D10A/D10N、E762Q、H983N/H983Y或D986N處的突變；和在H840A/H840N/H840Y或N863D/N863S/N863H處的突變。

7.如權(quán)利要求6所述的分離的蛋白，其中這些降低核酸酶活性的突變是：

(i)D10A或D10N，和

(ii)H840A、H840N、或H840Y。

8.一種融合蛋白，其包含使用任選的介入接頭與異源功能結(jié)構(gòu)域融合的、如權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)中所述的分離的蛋白，其中該接頭不干擾該融合蛋白的活性。

9.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其中該異源功能結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域。

10.如權(quán)利要求9所述的融合蛋白，其中該轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域來(lái)自VP64或NF-κB p65。

11.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其中該異源功能結(jié)構(gòu)域是轉(zhuǎn)錄沉默子或轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域。

12.如權(quán)利要求11所述的融合蛋白，其中該轉(zhuǎn)錄阻遏結(jié)構(gòu)域是克魯貝爾相關(guān)盒(KRAB)結(jié)構(gòu)域、ERF阻遏因子結(jié)構(gòu)域(ERD)或mSin3A相互作用結(jié)構(gòu)域(SID)。

13.如權(quán)利要求11所述的融合蛋白，其中該轉(zhuǎn)錄沉默子是異染色質(zhì)蛋白1(HP1)。

14.如權(quán)利要求13所述的融合蛋白，其中該轉(zhuǎn)錄沉默子是HP1α或HP1β。

15.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其中該異源功能結(jié)構(gòu)域是修飾DNA的甲基化狀態(tài)的酶。

16.如權(quán)利要求15所述的融合蛋白，其中該修飾DNA的甲基化狀態(tài)的酶是DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNMT)或TET蛋白。

17.如權(quán)利要求16所述的融合蛋白，其中該TET蛋白是TET1。

18.如權(quán)利要求8所述的融合蛋白，其中該異源功能結(jié)構(gòu)域是修飾組蛋白亞基的酶。

19.如權(quán)利要求18所述的融合蛋白，其中該修飾組蛋白亞基的酶是組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)、組蛋白脫乙酰酶(HDAC)、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶(HMT)或組蛋白脫甲基酶。