[發(fā)明專利]制造膜聯(lián)蛋白V的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201680053679.8 | 申請日： | 2016-09-16 |
| 公開（公告）號： | CN108137662B | 公開（公告）日： | 2022-08-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 托馬斯·莫克斯;揚·克里斯托弗·賴希 | 申請（專利權(quán)）人： | 安尼欣制藥有限公司 |
| 主分類號： | C07K14/47 | 分類號： | C07K14/47;A61K38/00 |
| 代理公司： | 中科專利商標(biāo)代理有限責(zé)任公司 11021 | 代理人： | 吳小明 |
| 地址： | 瑞典斯德哥爾摩*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 制造 蛋白 方法 | ||
1.一種從具有細(xì)胞壁的內(nèi)毒素產(chǎn)生宿主細(xì)胞中回收和/或提純包含膜聯(lián)蛋白A5(AnxA5)序列的重組表達(dá)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法包括
(I)從所述宿主細(xì)胞中釋放所述細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)，
其特征在于，釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白的步驟在包含非離子洗滌劑的勻化緩沖液的存在下執(zhí)行；
(II)使所述釋放的AnxA5蛋白經(jīng)過陰離子交換樹脂以便執(zhí)行第一陰離子交換步驟，并由此產(chǎn)生包含所述釋放的AnxA5蛋白的第一陰離子交換產(chǎn)物；和
(III)使所述釋放的AnxA5蛋白經(jīng)歷親和色譜步驟，由此產(chǎn)生包含所述釋放的AnxA5蛋白的第一親和色譜產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述方法不包括從所述宿主細(xì)胞中釋放所述AnxA5蛋白之后回收和/或提純所述AnxA5蛋白的任何離心步驟，并且/或者其中所述AnxA5蛋白除暫時地與任何色譜樹脂結(jié)合外，在整個方法中保留在溶液中。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述非離子洗滌劑是聚山梨醇酯。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述聚山梨醇酯選自吐溫20和吐溫80。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述聚山梨醇酯是吐溫80。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白的步驟在勻化緩沖液的存在下執(zhí)行，所述勻化緩沖液包含有效地減少或防止膜聯(lián)蛋白A5與內(nèi)毒素之間結(jié)合的量的非離子洗滌劑。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白的步驟在勻化緩沖液的存在下執(zhí)行，所述勻化緩沖液包含0.01至10％(w/w)非離子洗滌劑，如0.02至5％(w/w)、0.05至2％(w/w)或約1％(w/w)非離子洗滌劑。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的從具有細(xì)胞壁的宿主細(xì)胞中回收和/或提純包含膜聯(lián)蛋白A5(AnxA5)序列的重組表達(dá)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的方法，其中所述方法包括從所述宿主細(xì)胞中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白，
其中在從所述宿主細(xì)胞中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白時或者在從所述宿主細(xì)胞中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白之后，但在任何進(jìn)一步的色譜提純進(jìn)行之前，所述勻化緩沖液中的游離鈣離子濃度低于10mM，并且/或者
其中所述勻化緩沖液包含鈣金屬離子螯合劑，或者在釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白之后被改性而包含鈣金屬離子螯合劑。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中在從所述宿主細(xì)胞中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白時或者在從所述宿主細(xì)胞中釋放所述細(xì)胞內(nèi)AnxA5蛋白之后，但在任何進(jìn)一步的色譜提純進(jìn)行之前，所述勻化緩沖液中的游離鈣離子濃度低于5mM、1mM，或500μM，或者基本上為零。
10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述鈣金屬離子螯合劑選自EDTA或其鹽和EGTA或其鹽。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述鈣金屬離子螯合劑是EDTA。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述游離鈣離子的水平和/或鈣金屬離子螯合劑的量有效地降低或防止膜聯(lián)蛋白A5與所述宿主細(xì)胞的細(xì)胞壁成分之間的結(jié)合。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述勻化緩沖液在釋放所述AnxA5蛋白之前或之后包含或者被調(diào)節(jié)而包含選自0.01至500mM，0.05至100mM、0.5至20mM、1至15mM、2至10mM或約4mM的濃度的鈣金屬離子螯合劑。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中所述鈣金屬離子螯合劑是EDTA。
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