[發明專利]使用導電聚合物的游離DNA捕獲平臺以及該平臺的應用

在審

• 申請號: 201680047982.7
• 申請日: 2016-06-23
• 公開（公告）號: CN107980061A
• 公開（公告）日: 2018-05-01
• 發明（設計）人: 曹榮南;李銀淑
• 申請（專利權）人: 國立癌癥中心
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6886;C08L79/04;C08L101/12
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司44202
• 代理人: 郝傳鑫

技術領域

本發明涉及使用導電聚合物檢測游離DNA(cell-free DNA)的結構及其應用，更加具體而言，本發明涉及用于分離和檢測游離DNA(例如，循環腫瘤DNA)的由表面修飾的導電聚合物構成的納米結構。

背景技術

循環游離DNA的存在最先于1948年由Mandel和Metais報道。已在多種生理和病理條件(例如，炎性病變，氧化應激和惡性腫瘤)下對循環游離DNA(cfDNA)進行了研究。在健康的受試者體內，cfDNA的血液濃度為0-100ng/ml并且其平均血液濃度為30ng/ml。假設正常細胞中DNA的含量為6.6pg，該值對應于平均每毫升血液中0至15,000基因組等同物并且基因組的平均數目為5000/ml。在此，大多數DNA是雙鏈并且作為核蛋白復合物存在。

雖然與游離DNA釋放進入血流有關的準確機理尚不清楚，但是游離DNA釋放進入血流似乎受到細胞凋亡，壞死和細胞中的活性釋放的組合的影響。

循環游離DNA是一種潛在的有用生物標志物。DNA水平和碎裂模式顯示了用于診斷和預后目的的極大的可能性。最近，Bartoov等人介紹了一種基于對受試者的體液樣本中的cfDNA進行測量來評估男性受試者的生育能力的方法(WO2008/047364)。他們還說明了一種通過給藥DNase治療生育能力低的男性的方法。進一步而言，游離DNA被認為是用于無創監控惡性和良性增殖和炎性病癥(例如，子宮內膜異位癥)的生物標志物。

具體而言，在根據檢測癌癥特異性基因的方法診斷和監控癌癥方面，采用循環游離DNA中的循環腫瘤細胞(CTC)或循環腫瘤DNA(ctDNA)(其提取并分離自血液)的無創檢測預期會在癌癥的診斷領域做出貢獻。

使用無創血液樣本的癌癥診斷方法是一種非常引入關注的方法并且目前已吸引的大量關注。如果可從血液樣本中有效分離或捕獲CTC和ctDNA，那么它們可形成診斷和治療策略的基礎。此外，因為可定期選擇由于對抗癌藥物具有耐受性而產生的靶向腫瘤的基因改變的治療方法，所以傳統癌癥的治療可被最大化。

在患有各種不同的惡性實體腫瘤的患者的血液中作為上皮細胞存在的循環腫瘤細胞(CTC)源自原發性腫瘤克隆并且是惡性的(Fehm等人，[Clin.Cancer Res.8:2073-84,2002])。此外，已經報道了CTC可被認為是獨立于癌癥發展的診斷。

鑒于多種原因，在管理患者方面重要的是檢測和計算循環腫瘤細胞。循環腫瘤細胞可在原發性腫瘤形成之前進行檢測，由此產生早期診斷。因為循環腫瘤細胞對治療產生響應并且數量會減少，所以，CTC的計算可監控給定治療方案的效果。這樣的循環腫瘤細胞可用作監控如下患者體內疾病復發的工具，所述患者被給予佐劑并具有不可預期的疾病。

血液中具有非常少的CTC和ctDNA。例如，每10⁸個至10⁹個血液細胞中具有大約1個CTC和ctDNA。因此，已設計了幾種CTC分離方法。例如，使用微流體裝置的方法，其中，捕獲抗體與磁性顆粒結合，所述磁性顆粒上固定有抗EpCAM(上皮細胞粘附分子)抗體，或者所述捕獲抗體與具有柱狀結構的樹脂表面結合，等等，已知的分離方法是通過利用CTC與血液細胞之間的尺寸差異的過濾器等進行分離的方法(Isolation of rare periphery circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology.Sunitha Nagrath等人，Nature,2007,450:1235-1239)。

為了提取ctDNA，通常使用商售試劑盒。在Qiagen循環核酸試劑盒中，使用帶正電荷的二氧化硅膜引入DNA附著，并且所附著的DNA通過改變pH進行分離。然而，使用該試劑盒，采集效率仍然很低。

法國的Laurent研究組介紹了一種使用基于液滴的數字PCR通過識別腎癌患者的血漿中存在的ctDNA而對KRAS腫瘤形成基因進行量化的技術。美國Pennsylvania大學的Diamond研究組研究了使用帶正電荷的聚乙烯亞胺納米顆粒附著帶負電荷的DNA。具體而言，該技術通過將光可裂解的配體附著于納米顆粒表面并隨后用光輻照被配體捕獲的DNA而進行有效分離。中國德州學院的Wang研究組，使帶正電荷的聚合物附著于磁性納米顆粒并隨后通過改變pH實現基因DNA的有效附著和分離。