[發明專利]用多聚體結合試劑檢測細胞表型和定量

有效

• 申請號: 201680042567.2
• 申請日: 2016-07-14
• 公開（公告）號: CN107847544B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 馬克·M·戴維斯;黃俊
• 申請（專利權）人: 小利蘭·斯坦福大學董事會
• 主分類號: A61K38/00
• 分類號: A61K38/00;C12N15/09
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 倪婭;陳衛

根據和多聚體結合試劑接觸的目標受體的特異性，提供了標記細胞的方法和組分。多聚體結合試劑是基于一個“四聚體支架蛋白”，其四聚體支架蛋白具有低或無生物素親和力，并且在四聚體的一條或多條、通常四條多肽均上包含有C端的半胱氨酸殘基。支架蛋白在末端半胱氨酸經生物素化修飾，來提供多聚體結合試劑的中心部分。生物素化的四聚體和高親和力生物素結合蛋白四聚體結合。由此產生的復合物具有未被填充的生物素結合位點，其至多可容納十二個生物素標記的特異結合試劑，并且可用于各種親和力選擇和檢測形式。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種四聚體支架蛋白、其衍生的十二聚體支架、多聚體結合 試劑及應用。

交叉引用

根據35U.S.C.§119(e)，本申請要求優先權于2015年7月20日提交的美國臨時專利申請序列 號62/194,726，該申請的公開內容通過引用并入本發明。

背景技術

T淋巴細胞構成了機體抵抗細菌、病毒和原蟲感染的主要部分，并且參與了癌細胞的排斥。大量 的自體免疫綜合癥與抗原特異T細胞攻擊自體不同部位相關。因此，能夠在這些疾病發生過程中示蹤 抗原特異性T細胞非常有意義。而且，如果能夠對于某種疾病狀態，富集針對某個特定抗原的特異性 T細胞然后重新導入，或者在自體免疫失調情況下選擇性地將其去除，將具有巨大的治療效益。

T細胞受體(TCR)識別的抗原是以肽形式和主要組織相容性復合體(MHC)結合的分子 (pMHC)，pMHC位于抗原遞呈細胞表面。T細胞受體-pMHC相互作用決定了T細胞的選擇、發育、分化、命運和功能。然而，T細胞受體和pMHC的結合親和力非常低(K_d，～1-200μM，1000-200000倍弱于典型的抗體-抗原相互作用)以及在溶液中解離速率很快(K_off，～0.05S^-1)。

為了提高結合親和力和克服快速解離的問題，pMHC四聚體已被設計出用來檢測抗原特異性T細 胞——通過結合四個生物素化的pMHC單體到熒光標記的單個鏈霉親和素。這滿足了基礎和臨床免疫 學中的一個重要需求，即能夠鑒別和鑒定細胞群體中通常非常稀有的特異性T細胞。之后該方法在靈 敏度、生產工藝和組合標記方面的改進使其更加有用。

然而，四聚體在低親和范圍(～150μM)的結合有一個急劇下降，因此有了一些更高價的替代 物，包括五聚體、八聚體、葡聚糖聚體和基于量子點的多聚體。其中一些顯然提高了靈敏度，這對于 檢測非常低親和力的T細胞非常重要。例如，表達低水平和/或低親和力T細胞受體的初始T細胞和胸 腺細胞，顯示出低或無四聚體染色。進一步發現不結合抗原特異性四聚體的αβT細胞和γδT細胞仍能 產生顯著的抗原特異的細胞因子應答反應。另外，第二型MHC四聚體在飛行時間質譜細胞術 (CyTOF)中的應用也有問題，該方法是流式細胞術的先進版，可同時測量單個細胞上的超過40個參 數。

本發明提供了針對T細胞受體具有高親和力的試劑，該試劑具有一個直觀的簡單結構并生產便 宜，同時兼容目前的四聚體技術和商業上可獲得的鏈霉親和素結合物。該試劑可用于不同的分析形 式，包括流式細胞術和質譜細胞術。

參考文獻