[發明專利]一種能夠增強mRNA穩定性和可譯性的通用核酸藥物載體

有效

• 申請號: 201680035861.0
• 申請日: 2016-01-15
• 公開（公告）號: CN109104870B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 丁恩雨
• 申請（專利權）人: 丁恩雨
• 主分類號: C12N15/64
• 分類號: C12N15/64;C12N15/63;A61K48/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種通過分子生物學技術所構建的核酸載體pVec。pVec含有CMV增強子/啟動子、T7啟動子、5’非翻譯區(UTR)、多克隆位點、3’UTR、poly A(120A)?TTATT、BGH poly(A)信號、卡那霉素抗性基因和pUC起點等。因此，pVec可用作DNA疫苗或治療藥物以及mRNA疫苗或mRNA治療藥物的載體。pVec中的5’UTR、3’UTR和poly A(120A)?TTATT能夠被分別添加到體外轉錄mRNA的5’和3’端，并能穩定所轉錄的mRNA。此外，本發明還提供了構建的pVec?GM?CSF、pVec?hIL?12和pVAX1?hIL?12，來進一步評價pVec。

描述

發明背景

本發明涉及生物技術領域內的核酸藥物。尤其是，本發明涉及一種增強mRNA穩定性和可譯性的通用核酸藥物載體。

核酸藥物系應用DNA和RNA作為疫苗或治療藥物在臨床上用于預防和治療疾病。

多年來，RNA被認為是不穩定的，且易于降解。因此，核酸藥物，尤其是核酸疫苗的研究，大多數是基于DNA疫苗。DNA疫苗是含有外源抗原基因序列的質粒DNA。它被遞送到宿主體中并通過細胞膜和核膜進入細胞核。在細胞核內，被遞送的外源抗原基因DNA被轉錄成mRNA，然后被轉運到細胞質內，并翻譯成蛋白質。表達的蛋白能誘導抗原免疫應答，達到預防和治療癌癥、病毒性疾病等目的。常用的DNA疫苗載體包括pcDNA3.1和pVAX1。其中，pcDNA3.1被美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration，FDA)禁止用于人類臨床，這是因為pcDNA3.1含有氨芐青霉素抗性基因。由于DNA疫苗不容易通過細胞膜和核膜，只有少數DNA分子可以進入細胞核內，使得難以刺激機體并進一步引起強烈的免疫應答。因此，尚未有DNA疫苗被批準用于人類臨床。目前，所應用的電穿孔方法大大提高了DNA疫苗的轉染效率和免疫效果，但仍然存在質粒DNA是否整合到宿主細胞基因組中的擔憂。

近年來，質粒載體的改進提高了體外轉錄mRNA的穩定性，使我們的注意力轉向mRNA藥物，特別是mRNA疫苗。在pGEM4Z/A64載體的基礎上，構建了pGEM4Z/GFP/A64和pGEM4Z/OVA/A64，并將其作為產生體外轉錄mRNA的模板。所產生的mRNA通過鼻內途徑接種以誘導抗腫瘤免疫[Phua KK，et al.Sci Rep.2014；4：5128]。應用pcDNA3.1-64A和pSP73-Sph/A64，分別構建幾種含有腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens，TAAs)、糖皮質激素誘導的TNFR相關蛋白單克隆抗體(glucocorticord-induced TNFR-related proteinmonoclonal antibody，GITR mAb)和細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白-4單克隆抗體(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4 mAb，CTLA-4 mAb)的載體，并將其用于產生相應的體外轉錄mRNA，后者被電穿孔至樹突細胞(DC)。獲得的DC-mRNA疫苗用于增強抗腫瘤免疫[Pruitt SK，et al.Eur J Immunol.2011；41(12)：3553-63]。pSpjC-βglacZβga_n和pT7TSβggfpβga_n被分別構建，導致LacZ基因和綠色熒光蛋白(green fluorescentprotein，GFP)基因兩側分別為5’-非翻譯區(untranslated region，UTR)和3’-非翻譯區(from xenopus laevisβ-globin)[Hoerr I，et al.Eur J Immunol.2000；30(1)：1-7]。應用由V.F.I.Van Tendeloo提供的pSP64-Poly(A)-EGFP-2，分別構建含有腫瘤相關抗原(tumor-associated antigens，TAAs)如粘蛋白1(mucin 1，MUC1)、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、人表皮生長因子受體2(human epidermal growthfactor receptor 2，Her-2/neu)、端粒酶(telomerase)、存活素(survivin)、黑色素瘤相關抗原1(melanoma-associated antigen 1，MAGE-1)的載體，將其作為模板用于產生體外轉錄的mRNA，進一步用于抗腫瘤免疫[Rittig SM，et al.Mol Ther.2011；19(5)：990-9]。此外，5’UTR被人工合成，且被用于增加mRNA的穩定性[Andreas Thess.US 20150050302A1.Artificial nucleic acid molecules comprising a 5’top utr]。應用pST1-Sp-MITD-2hBgUTR-A120，分別構建幾種含有多個突變主要組織相容性復合物(MHC)II類表位序列的載體，并作為模板產生體外轉錄的mRNA，然后將其接種到體內以產生個性化抗癌免疫[Kreiter S，et al.Nature 2015；520(7549)：692-6]。