[發明專利]用于篩選氣味劑和芳香受體的細胞系

在審

• 申請號: 201680033740.2
• 申請日: 2016-06-09
• 公開（公告）號: CN107912047A
• 公開（公告）日: 2018-04-13
• 發明（設計）人: H·Y·鄭;P·菲斯特;M·羅杰斯
• 申請（專利權）人: 弗門尼舍有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C07K14/47;G01N33/68
• 代理公司: 北京三幸商標專利事務所(普通合伙)11216
• 代理人: 劉卓然

技術領域

本技術領域涉及氣味劑和芳香受體，以及可用于鑒定氣味劑和/或芳香化合物或這種調節劑的測定法。該測定法更具體地針對顯示出改善的氣味劑受體活性的工程化細胞系。

背景技術

通過揮發性調味與香味化合物和駐留在嗅覺上皮組織的嗅覺受體神經元的膜上的氣味劑受體(OR)蛋白質之間的相互作用，氣味最初被編碼在外周嗅覺系統(即鼻子)中。這樣的相互作用以氣味特異性組合方式發生，其中任何單個OR可以被多種氣味劑激活，并且相反地，大多數氣味劑能夠激活若干不同的OR。對于給定的氣味劑/芳香化合物或混合物，這些受體相互作用在大腦中產生神經生理學信號并最終產生有意識的氣味感知。人類基因組中約400個OR基因可被數千或更多的氣味刺激物激活，這是氣味劑與受體之間的組合相互作用的固有復雜性，其允許我們可以感知的嗅覺的廣度。闡明這些相互作用可以導致發現有益的產品，包括但不限于阻斷不適氣味感知的惡臭抵消劑，替代不可生物降解或有毒化合物的新的調味和香味成分，以及限制我們難以從天然來源追溯化合物的依賴性的氣味增強劑。

需要例如但不限于可以在細胞表面上功能性地表達OR以便OR編碼的可靠解碼的新方法。還需要一種方法，其在非嗅覺細胞(例如但不限于異源細胞系)中功能性地表達OR，這些非嗅覺細胞經得起用揮發性調味和香味化合物文庫進行高通量篩選而用于OR活性的全面表征。這可以顯著加速發現非常理想的惡臭抵消劑、氣味調節劑和新的調味或香味化合物。

源自嗅覺感覺神經元的某些蛋白質可以改善非嗅覺細胞系中氣味劑受體的細胞表面定位。這些蛋白質通過協助將氣味劑受體從內質網運輸到細胞的高爾基體和質膜而起作用。據報道，受體轉運蛋白1(RTP1)、受體轉運蛋白2(RTP2)和受體表達增強蛋白1(REEP1)改善氣味劑受體質膜定位并因此在非嗅覺細胞中起作用。據報道，RTP1是最有效的氣味劑受體伴侶蛋白。已經證明這種蛋白質部分地通過與內質網中的氣味劑受體相互作用而起作用。因此，經得起高通量篩選且含有RTP1基因的非嗅覺細胞系非常理想地用于全面解碼氣味劑與氣味劑受體之間的組合相互作用。

更期望的是這樣一種細胞系，其通過穩定地表達來自內源性RTP1基因座的基因，連續地產生RTP1蛋白(包括但不限于RTP1S)。然而，開發穩定表達內源性RTP1基因的細胞系的現有技術涉及將DNA插入到培養細胞中的低效且麻煩的分子生物學方法，如若不然該培養細胞不表達該基因。因此，希望使用這樣一種技術，其避免這種方法來開發穩定的細胞系并且允許內源性RTP1的連續表達而不需要使用重組方法。

CRISPR/Cas9是一種高效的基因組編輯工具，用于生成精確的基因組修飾，例如插入和缺失。例如，CRISPR/Cas9的一種特定用途使得能夠表達基因，如若不然該基因在細胞系中會沉默。通過在基因的上游整合轉錄啟動子，細胞系可以表達內源性基因，如若不然該內源性基因是非活性的。

發明內容

一種細胞，在該細胞內包含激活的內源性RTP1基因，其中該細胞還表達RTP1蛋白。

本文提供了具有改善的氣味劑受體功能的非嗅覺細胞系，其包含激活的內源性RTP1基因。

本文提供了一種非嗅覺細胞系，在該細胞內包含激活的內源性RTP1基因，其還表達RTP1蛋白。

本文還提供了一種在真核細胞中激活內源性RTP1基因的方法，包括：

a.引入與RTP1基因上游的基因組靶位點互補的向導RNA；

b.引入Cas核酸酶蛋白以與向導RNA形成復合物；和

c.使用向導RNA/Cas9基因組靶向復合物來特異性遞送RTP1基因的基因激活元件。

本文還提供了一種鑒定化合物的方法，該化合物激活、模擬、阻斷、抑制、調節和/或增強嗅覺受體在非嗅覺細胞中的活性，其中該細胞包含激活的內源性RTP1基因，其中該方法還包括：

a.使該受體或其嵌合體或片段與激活、模擬、阻斷、抑制、調節和/或增強該受體的化合物接觸；和

b.確定該化合物是否對該受體的活性有影響。

附圖說明

圖1顯示了內源性RTP1基因座和用于基因組編輯的特定靶位點的示意圖。

圖2顯示了CMV啟動子插入過程的示意圖。

圖3顯示野生型和重組等位基因以及相應的基因型區域的示意圖。

圖4顯示了工程化細胞系中CMV啟動子整合的表征。