[發(fā)明專利]產生芐基異喹啉生物堿(BIA)前體的微生物及其制備和使用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680030359.0
• 申請日: 2016-05-04
• 公開（公告）號: CN107614688B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發(fā)明（設計）人: 克里斯蒂娜·D·斯默克;凱瑟琳·托德利;伊西斯·特倫查德
• 申請（專利權）人: 小利蘭·斯坦福大學托管委員會
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/79;C12N15/81;C12P13/22;C12P17/12
• 代理公司: 北京市君合律師事務所 11517
• 代理人: 何箏;顧云峰

1.一種形成含有芐基異喹啉生物堿產物的產物流的方法，所述方法包括：

(a) 向間歇式反應器提供工程化非植物細胞以及包含營養(yǎng)物和水的原料，所述工程化非植物細胞具有導致相對于非工程化非植物細胞過度產生酪氨酸的以下修飾：反饋抑制減輕突變、轉錄調節(jié)修飾和失活突變，

其中所述反饋抑制減輕突變與第一酶相關，所述第一酶選自：3-脫氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶和分支酸變位酶，

所述轉錄調節(jié)修飾增加第二酶的表達，所述第二酶選自：轉酮醇酶和苯丙酮酸脫羧酶，以及

所述失活突變與第三酶相關，所述第三酶為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；

(b) 在所述間歇式反應器中，通過將所述工程化非植物細胞培養(yǎng)至少約5分鐘的時間使所述工程化非植物細胞發(fā)酵，以產生包含所述芐基異喹啉生物堿產物和細胞材料的溶液；和

(c) 使用至少一個分離單元將所述芐基異喹啉生物堿產物與所述細胞材料分離以提供包含所述芐基異喹啉生物堿產物的產物流。

2.根據權利要求1所述的方法，其中所述溶液包含不超過一種類別的選自以下組的分子：原小檗堿、嗎啡喃、異帕威堿、阿樸啡和雙芐基異喹啉。

3.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述工程化非植物細胞是工程化酵母細胞。

4.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述工程化非植物細胞包含編碼3-脫氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶的一種或多種生物合成酶基因中的一個或多個反饋抑制減輕突變。

5.根據權利要求4所述的方法，其中所述一個或多個反饋抑制減輕突變存在于所述3-脫氧-d-阿拉伯糖-庚酮糖酸-7-磷酸合酶基因中。

6.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述工程化非植物細胞包含編碼分支酸變位酶的一種或多種生物合成酶基因中的一個或多個反饋抑制減輕突變。

7.根據權利要求6所述的方法，其中所述一個或多個反饋抑制減輕突變存在于所述分支酸變位酶基因中。

8.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述間歇式反應器的至少一個工藝參數是可修改的，以改變所得的芐基異喹啉生物堿產物組成，其中所述可修改的至少一個工藝參數包括溶解氧、pH、攪拌速度、通氣速率和細胞密度中的至少一個。

9.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述芐基異喹啉生物堿產物選自以下組：去甲烏藥堿、全去甲勞丹堿、酪氨酸、酪胺、4-羥基苯乙醛、4-羥基苯丙酮酸、L-3,4-二羥基苯丙氨酸、3,4-二羥基苯乙醛和多巴胺。

10.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述芐基異喹啉生物堿產物是具有選自以下組的結構類別的芐基異喹啉生物堿：芐基異喹啉、原小檗堿、原阿片堿、苯并菲啶、原嗎啡喃、嗎啡喃、斷裂小檗堿、苯酞異喹啉、阿樸啡和雙芐基異喹啉。

11.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述產物流不包含多于5 ppm的選自以下組的分子：木質素、色素、類黃酮、類菲、乳膠、核酮糖二磷酸羧化酶、袂康酸、假嗎啡、那碎因、蒂巴酚和花粉。

12.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述產物流不包含可檢測量的選自由殺蟲劑、殺真菌劑或除草劑組成的組的物質。

13.根據權利要求1-2中任一項所述的方法，其中所述工程化非植物細胞包含三個異源編碼序列，其中所述三個異源編碼序列編碼參與將酪氨酸轉化為所述芐基異喹啉生物堿產物的代謝途徑的第一酶、第二酶和第三酶，其中所述第一酶、第二酶和第三酶沿所述代謝途徑可操作地連接。