[發明專利]ETV2及其用途

在審

• 申請號: 201680024200.8
• 申請日: 2016-03-03
• 公開（公告）號: CN108024522A
• 公開（公告）日: 2018-05-11
• 發明（設計）人: D·J·加里;M·G·加里;T·拉斯穆森;N·小谷野中川
• 申請（專利權）人: 明尼蘇達大學董事會
• 主分類號: A01K67/00
• 分類號: A01K67/00;A01K67/027;C12N15/00;C12N15/09
• 代理公司: 北京派特恩知識產權代理有限公司 11270
• 代理人: 景鵬;姚開麗

本文描述了產生表達人ETV2基因的嵌合非人動物的方法，包括：a)生成ETV2無效的非動物細胞，其中非人ETV2基因的兩個拷貝都攜帶防止在所述非人動物中產生功能性ETV2蛋白的突變；b)通過體細胞核轉移創建ETV2無效的非人胚泡，所述體細胞核轉移包括將a)的所述ETV2無效的非人動物細胞的核融合到去核的非人卵母細胞中，并激活所述卵母細胞分裂，從而形成ETV2無效的非人胚泡；c)將人干細胞引入b)的ETV2無效的非人胚泡；以及d)將來自c)的所述胚泡植入假孕替代非人動物中，以生成表達人ETV2的嵌合非人動物。

優先權聲明

本申請要求2015年3月3日提交的美國臨時專利申請第62/127,330號的優先權權益，據此要求該臨時申請的優先權權益，并通過引用將該臨時申請全部并入本文。

序列表

此文件通過引用在本文并入了電子序列表文本文件，該文本文件通過EFS-Web以電子格式提交。該文本文件稱為“1552048.txt，”，12,288個字節，并且創制于2016年3月1日。

背景技術

血液是人體的主要器官。其由細胞和血漿組成。細胞部分包括紅細胞、白細胞和血小板。血漿成分由水和溶解的化合物，尤其是如蛋白、糖或電解質組成。

血液的形成開始于原腸胚形成的過程中。第一造血譜系出現于卵黃囊的血島中。造血前體細胞的分化受遺傳程序的調節。最近證明，該遺傳程序的關鍵因子是基因Ets變異基因2(Etv2)(Stem cells.2012August；30(8)：1611-1623.doi：10.1002/stem.1131)。小鼠Etv2基因的除去導致卵黃囊喪失造血譜系和內皮譜系。Etv2基因在Etv2-突變體中的強制過表達恢復了血液譜系和內皮譜系。Genesis 2013Jul：51(7)：471-480.Doi：10.1002/dvg.22396。

血液障礙可影響紅細胞的產生(即貧血)、白細胞的增殖(即白血病)或血小板的凝固(即凝血病)。捐贈的血液用于治療這些不同的障礙。紅細胞用于治療患有與鐮狀細胞貧血病、地中海貧血、再生障礙性貧血、白血病或癌癥有關的慢性貧血的患者。血小板用于控制經歷外科手術的患者的出血。目前，人血液的唯一來源就是人供體。

發明概述

本發明基于豬中Etv2基因缺失導致在造血內皮(hematoendothelial)發育前期步驟造血譜系和內皮譜系的消融這一新發現。本發明生成了缺乏豬Etv2基因(并因此缺乏豬血管和血液)的豬胚泡。通過將人干細胞如Etv2基因陽性iPS細胞注射到突變的豬(缺乏Etv2)胚泡，本發明生成了衍生自人干細胞如iPS細胞的人或人源化血液和血管。每年，超過300,000名美國人經歷冠狀動脈旁路移植術，并且會從使用這類工程化的冠狀血管中獲益。

本文描述了ETV2敲除豬或其他動物如牛或山羊的開發，作為用于產生臨床應用的個性化人/人源化血液和血管的宿主。生成血液的祖細胞還生成代表血管內襯的內皮。在缺少內皮的情況下，沒有血管，并且發育的胚胎是不能存活的。除了充當用于治療心血管疾病和造血疾病的人/人源化組織的新來源之外，人源化豬還會充當研究人譜系再生和對藥物應答的大型動物模型。發現Etv2作為傳統心血管轉錄因子和造血內皮轉錄因子以及信號傳導級聯的靶標，已證明Etv2調節造血內皮譜系的特化和分化。此外，已經注意到Etv2變異小鼠胚胎是不能存活的，并且缺少內皮/血管譜系和造血譜系。利用基因編輯技術，進一步確立ETV2變異豬胚胎缺乏造血譜系和內皮譜系。基于這些結果，Etv2是發育過程中造血內皮譜系的主調節劑。本文描述了人源化遺傳修飾生物替代物的工程化。

一實施方案提供了非人動物細胞或胚泡，其中基因組在ETV2基因的兩個等位基因中都攜帶突變，從而使得非人動物細胞或胚泡缺乏功能性ETV2蛋白。在一實施方案中，突變是缺失ETV2基因。在另一實施方案中，非人動物細胞或胚泡是豬、牛、馬或山羊。