[發(fā)明專利]DNA合成的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201680022296.4 | 申請日： | 2016-02-17 |
| 公開（公告）號： | CN107532210B | 公開（公告）日： | 2023-08-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 保羅·羅斯韋爾;尼爾·波特;L·瓦伊尼;T·艾迪 | 申請（專利權(quán)）人： | 塔馳萊特IP有限公司 |
| 主分類號： | C12Q1/6806 | 分類號： | C12Q1/6806;C12N15/113;A61K31/713;A61K48/00 |
| 代理公司： | 隆天知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 72003 | 代理人： | 付文川;王芝艷 |
| 地址： | 英國*** | 國省代碼： | 暫無信息 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | dna 合成 方法 | ||
1.一種生產(chǎn)包含所需脫氧核糖核酸(DNA)序列的共價閉合DNA的體外無細胞方法，所述方法包括：
(a)通過如下步驟產(chǎn)生固定化的單鏈DNA：使固定化在固體支持物上的寡核苷酸在有至少一種DNA聚合酶存在下、在促進所述固定化的寡核苷酸的3’末端的模板依賴性延伸的條件下與模板寡核苷酸接觸，去除所述模板并連續(xù)使用另外的模板寡核苷酸以產(chǎn)生第一DNA鏈，該鏈包含所需DNA序列且進一步包含在固體支持物近側(cè)的原核端粒酶靶序列的第一部分，所述模板寡核苷酸包含與固定化的寡核苷酸的3’末端互補的序列和懸突至固定化的寡核苷酸的3’末端的5’序列，所述另外的模板寡核苷酸在序列上重疊以形成與所需DNA序列互補并用于固定化的寡核苷酸的進一步延伸的序列；
(b)在(a)中產(chǎn)生的所述第一DNA鏈的遠側(cè)部分中或在第二鏈上引入包含(a)的原核端粒酶靶序列的第二部分的DNA序列，使得所述原核端粒酶靶序列的第一部分和第二部分由此建立在所述固體支持物近側(cè)的(a)的原核端粒酶的完整靶序列；和
(c)使在所述固體支持物近側(cè)的原核端粒酶的完整靶序列在促進所述靶序列的切割和重連的條件下與原核端粒酶接觸，由此釋放產(chǎn)生的固定化的DNA，
其中，所述原核端粒酶靶序列選自SEQ?ID?NO:15的細菌噬菌體N15?TelN靶序列、SEQID?NO:16的克雷伯氏菌屬噬菌體Phi?K02靶序列、SEQ?ID?NO:17的耶爾森氏菌屬噬菌體PY54靶序列、SEQ?ID?NO:18的弧菌屬噬菌體VP882靶序列、SEQ?ID?NO:19的布氏疏螺旋體靶序列、SEQ?ID?NO:20的根癌土壤桿菌TelA靶序列和SEQ?ID?NO:21的副溶血弧菌質(zhì)粒Vp58.5靶序列，其中所述固體支持物選自平板、珠子、雜交芯片、膜、晶體和陶瓷制品，并且其中所述第一部分和第二部分的長度為至少14個堿基且分別為原核端粒酶的靶序列的有義部分或反義部分之一。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中(a)的固定化的寡核苷酸包含原核端粒酶靶序列的第一部分。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中將原核端粒酶靶序列的第一部分通過模板依賴性延伸引入第一DNA鏈中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，所述方法用于生產(chǎn)包含一個或多個發(fā)夾的單鏈環(huán)形DNA，至少一個發(fā)夾包含原核端粒酶的靶序列的一部分，其中所述一部分的長度為至少14個堿基且為原核端粒酶的靶序列的有義部分或反義部分。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(b)包括使用一種或更多種模板寡核苷酸的模板依賴性延伸，以在第一DNA鏈的遠側(cè)端部引入特定序列，所述特定序列與位于固體支持物近側(cè)的第一DNA鏈的序列互補，并且與第一DNA鏈的序列互補的序列的退火形成單鏈DNA環(huán)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述方法包括模板依賴性延伸，以在第一DNA鏈的遠側(cè)端部引入與(a)的原核端粒酶的所述靶序列的第一部分的3’側(cè)接區(qū)域中的序列互補的序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述方法包括模板依賴性延伸，以在第一DNA鏈的遠側(cè)端部引入(a)的原核端粒酶的靶序列的第二互補部分和任選的與(a)的原核端粒酶的靶序列的第一部分的5’側(cè)接區(qū)域中的序列互補的序列，其中所述第二互補部分的長度為至少14個堿基且為原核端粒酶的靶序列的反義部分或有義部分。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，所述方法還包括所述DNA環(huán)的3’末端的模板依賴性延伸，以建立在所述固體支持物近側(cè)的所述完整原核端粒酶靶序列。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(a)包括使用一種或多種模板寡核苷酸的模板依賴性延伸，以在第一DNA鏈的遠側(cè)端部引入兩個互補序列，所述互補序列能夠退火在一起以形成發(fā)夾。
10.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中步驟(a)包括使用一種或多種模板寡核苷酸的模板依賴性延伸，以在第一DNA鏈的遠側(cè)端部引入兩個互補序列，所述互補序列能夠退火在一起以形成發(fā)夾。
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