[發(fā)明專利]核糖核酸的無細(xì)胞生成

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680019707.4
• 申請(qǐng)日: 2016-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN107614682B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: W.J.布萊克;D.S.坎寧安;D.麥凱克蘭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 綠光生物科技股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/09
• 分類號(hào): C12N15/09;C12N15/11;C12N15/10;C12N1/21;C40B40/08
• 代理公司: 北京市柳沈律師事務(wù)所 11105
• 代理人: 張文輝

1.生成RNA的方法，所述方法包括：

(a) 將第一細(xì)胞群體培養(yǎng)至期望的細(xì)胞密度，其中所述細(xì)胞包含至少一種工程化核酸，所述工程化核酸含有與編碼核酸酶的序列可操作連接的啟動(dòng)子，所述核酸酶包含蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)并且與周質(zhì)靶向序列連接，其中在所述細(xì)胞中將至少一種內(nèi)源核糖核酸酶遺傳失活或經(jīng)由靶向蛋白水解失活；

(b) 裂解步驟(a)中生成的細(xì)胞，從而生成第一細(xì)胞裂解物；

(c) 在導(dǎo)致RNA解聚的條件下溫育所述第一細(xì)胞裂解物，從而生成含有核苷酸5’-單磷酸的第一細(xì)胞裂解物；

(d) 培養(yǎng)包含以下項(xiàng)的細(xì)胞的第二群體：(i)至少一種工程化核酸，其含有與編碼關(guān)聯(lián)蛋白酶的序列可操作連接的啟動(dòng)子，所述關(guān)聯(lián)蛋白酶切割所述核酸酶的蛋白酶識(shí)別位點(diǎn)，其中所述關(guān)聯(lián)蛋白酶與周質(zhì)靶向序列連接，(ii)至少一種工程化核酸，其含有與編碼核苷酸激酶的序列可操作連接的啟動(dòng)子，(iii)至少一種工程化核酸，其含有與編碼RNA聚合酶的序列可操作連接的啟動(dòng)子，和(iv)工程化脫氧核糖核酸(DNA)模板，其含有與編碼RNA的序列可操作連接的啟動(dòng)子，其中在所述細(xì)胞中將至少一種內(nèi)源核糖核酸酶遺傳失活或經(jīng)由靶向蛋白水解失活；

(e) 裂解步驟(d)中生成的培養(yǎng)細(xì)胞，以生成第二細(xì)胞裂解物；

(f)組合步驟(b)中生成的所述第一細(xì)胞裂解物、步驟(e)中生成的所述第二細(xì)胞裂解物、和多磷酸鹽，從而生成混合物；并且

在導(dǎo)致RNA生成的條件下溫育所述混合物。

2.權(quán)利要求1的方法，其中所述與編碼核酸酶的序列可操作連接的步驟(a)的啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型的。

3.權(quán)利要求1的方法，其中步驟(d)(i)、(d)(ii)或(d)(iii)中任一項(xiàng)的所述啟動(dòng)子中的至少一種是誘導(dǎo)型的。

4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)的所述核酸酶選自下組：S1核酸酶、NucA、PNP酶、RNA酶II、RNA酶III、和RNA酶R。

5.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(a)和/或(d)的所述細(xì)胞含有至少一種蛋白酶靶向性內(nèi)源核糖核酸酶和/或編碼內(nèi)源核糖核酸酶的基因中的至少一種染色體缺失。

6.權(quán)利要求5的方法，其中步驟(a)的至少一種內(nèi)源核糖核酸酶選自下組：RNA酶III、RNA酶I、RNA酶R、PNP酶、RNA酶II、RNA酶T、RNA酶E及其組合。

7.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(d)(ii)的所述核苷酸激酶是核苷酸單磷酸激酶。

8.權(quán)利要求7的方法，其中所述核苷酸單磷酸激酶選自下組：尿苷酸激酶、胞苷酸激酶、鳥苷酸激酶、和腺苷酸激酶。

9.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中所述核苷酸激酶是核苷酸二磷酸激酶。

10.權(quán)利要求9的方法，其中所述核苷酸二磷酸激酶選自下組：核苷磷酸激酶、丙酮酸激酶、和多磷酸激酶。

11.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)的方法，其中在所述細(xì)胞中使至少一種降解多磷酸鹽的步驟(a)和/或(d)的內(nèi)源酶遺傳失活。

12.權(quán)利要求11的方法，其中所述降解多磷酸鹽的內(nèi)源酶中的至少一種選自下組：核苷單磷酸酶、核苷二磷酸酶、核苷三磷酸酶、核苷三磷酸磷酸水解酶、和外切聚磷酸酶。

13.權(quán)利要求11的方法，其中步驟(a)和/或(d)的所述細(xì)胞含有至少一種降解多磷酸鹽的蛋白酶靶向性酶和/或編碼降解多磷酸鹽的酶的基因中的至少一種染色體缺失。

14.權(quán)利要求1或3中任一項(xiàng)的方法，其中步驟(d)(iii)的所述RNA聚合酶是DNA依賴性RNA聚合酶。