[發(fā)明專利]用于對循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行測序的血液樣品處理

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201680009769.7
• 申請日: 2016-02-05
• 公開（公告）號: CN107208164A
• 公開（公告）日: 2017-09-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 達(dá)米安·邦德;克里斯多佛·斯坦利
• 申請（專利權(quán)）人: 泊克瑪科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京安信方達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11262
• 代理人: 王瑋瑋,鄭霞

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種用于以能夠?qū)ρh(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效的基因組DNA測序的方式處理血液樣品的方法。

已知患有不同癌癥的患者的血液中存在循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)。所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞是罕見的細(xì)胞并且通常每毫升血液可能僅存在1到1,000個細(xì)胞。血液中存在的其他細(xì)胞數(shù)量上大大超過所述循環(huán)腫瘤細(xì)胞，這使得通過細(xì)胞化學(xué)技術(shù)或分子技術(shù)對CTC進(jìn)行分析變得復(fù)雜。

背景技術(shù)

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)在癌癥中的確切作用仍舊未被完全理解。認(rèn)為它們是癌癥擴(kuò)散到全身的機(jī)制。當(dāng)前了解到細(xì)胞發(fā)生突變使控制細(xì)胞生長的機(jī)制失去活性。很可能存在具有不同影響的多位點(diǎn)突變，如引起抗藥性的多位點(diǎn)突變。CTC的水平隨著腫瘤負(fù)荷增大而升高，并且這個特征用于使用Veridex公司的CellSearch儀器監(jiān)測對例如乳腺癌的療效。要求在分析之前提取、富集并純化CTC。

在例如10mL體積的全血中捕獲少量CTC具有巨大的挑戰(zhàn)性，該全血中將含有約4千萬到1億個白細(xì)胞和高達(dá)550億個紅細(xì)胞。

所有這些CTC富集方法的關(guān)鍵問題是CTC的內(nèi)在脆弱性難題。

陽性富集技術(shù)過去一直用于選擇和捕獲CTC，這些技術(shù)包括使用細(xì)胞特異性抗體包被珠的免疫磁性分離法(IMS)、或依賴于CTC與血細(xì)胞(如白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板)之間的大小差異的替代性物理誘捕法。IMS過程通常包括使用CTC特異性抗體，如抗EpCam。這種抗原是被認(rèn)為僅存在于源自腫瘤的循環(huán)細(xì)胞中而不存在于血細(xì)胞表面上的上皮細(xì)胞表面標(biāo)志。

所有這些陽性CTC選擇技術(shù)的缺點(diǎn)是它們依賴于可能不存在于所有CTC中的細(xì)胞特征。例如，不是所有CTC可以表達(dá)EpCam，因此它們不會被IMS技術(shù)檢測到。并且，在血液中不是所有CTC都可以具有比白細(xì)胞更大的直徑，特別是當(dāng)細(xì)胞處于早期發(fā)育階段并且也許非常容易受到處理的影響。這些較小的細(xì)胞不會被旨在富集大得多的細(xì)胞的物理誘捕技術(shù)保持住。因此，在正選擇技術(shù)下，存在以下風(fēng)險：一些CTC不會在富集的級分中存在，而這將導(dǎo)致假陰性診斷測試結(jié)果。

在一些癌癥中，例如胰腺癌，似乎沒有EpCam表達(dá)或所述表達(dá)非常有限。在這些癌癥中，認(rèn)為CTC改變了其表型并且能失去上皮細(xì)胞特征而在特征上成為間充質(zhì)；這可能是CTC擴(kuò)散到全身的階段。已知的抗EpCam抗體捕獲機(jī)制因此在癌癥最危險并且轉(zhuǎn)移到全身時可能不起作用。這個不能檢測到這樣的CTC的問題在本發(fā)明中得以克服。

負(fù)選擇技術(shù)、即從樣品中移除CTC以外的細(xì)胞現(xiàn)在作為減少假陰性結(jié)果的方式在積極考慮當(dāng)中。負(fù)選擇技術(shù)依賴于高效地移除可能損害到對樣品中存在的CTC的檢測的所有血細(xì)胞，在懸液中只留下剩余的互不干擾血細(xì)胞和CTC。負(fù)選擇方法因此不取決于CTC細(xì)胞的任何特異性特征并且因此作為一種富集技術(shù)更廣泛地適用。然而，尤其是當(dāng)使用分子分析法(如PCR或測序)來分析CTC基因組的突變時，希望負(fù)選擇方法通過確保高效移除白細(xì)胞來減少特定野生型背景(來自其他有核細(xì)胞中的非突變基因)和源自血液中其他有核細(xì)胞的過量DNA的總體PCR干擾。

US 7205157 B(JURGENSEN等人)04/04/2007提出了通過使用適當(dāng)抗體包被磁珠的陽性或負(fù)選擇法在包含采收浮子的管中進(jìn)行離心來從樣品流體分離罕見細(xì)胞。在負(fù)選擇方法中，通過從中間層移液來將CTC收集在采收器中。所描述的兩種方法不足以滿足能夠?qū)ρh(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行有效測序的要求。離心方法可能徹底破壞一些感興趣的細(xì)胞，并且鑒于這些細(xì)胞是罕見的，這對最終樣品的可用性具有巨大的影響。所使用的磁珠直徑通常在4到5μm之間，發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其與在樣品中引起顯著聚集和凝集的紅細(xì)胞非特異性締合，意外地在凝團(tuán)中捕獲感興趣的細(xì)胞。在美國專利7205157B中描述的負(fù)選擇方法中，所形成的CTC細(xì)胞的帶不深并且在不捕獲大量淡黃色上層的情況下用移液器單獨(dú)吸取CTC細(xì)胞非常困難。美國專利7205157B中描述的正選擇法存在與其他正選擇方法相同的缺點(diǎn)。Yang等人(生物技術(shù)與生物工程(Biotechnology and Bioengineering)2009，102卷，第2期)描述了使用紅細(xì)胞裂解、之后在負(fù)選擇方法中移除CD45+細(xì)胞。Yang等人闡述了為了CTC檢測最佳，需要完全移除紅細(xì)胞。