[發(fā)明專(zhuān)利]用于制備肉毒桿菌毒素的培養(yǎng)基組合物

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201680004193.5
• 申請(qǐng)日: 2016-04-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107109353A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 金敬倫;薛憓瑩;閔庚旼
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 株式會(huì)社大熊
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/20
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/20;C12P21/02;C12R1/145
• 代理公司: 北京坤瑞律師事務(wù)所11494
• 代理人: 陳桉

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的培養(yǎng)基組合物，且更具體地，涉及用于培養(yǎng)能夠生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的梭菌屬(Clostridium)的菌株的培養(yǎng)基組合物。本發(fā)明的培養(yǎng)基組合物包含酪蛋白水解物和至少一種選自下組的植物來(lái)源的蛋白胨：豌豆(garden pea)水解物、棉籽水解物和小麥面筋(wheat gluten)水解物。

發(fā)明背景

自19世紀(jì)90年代以來(lái)，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了分泌神經(jīng)毒性毒素的多種梭菌屬菌種(Clostridium sp.)，并且過(guò)去70年已經(jīng)進(jìn)行從這些細(xì)菌分泌的毒素的表征(Schant,E.J.等,Microbiol.Rev.,56:80,1992)。

自梭菌屬菌種衍生的神經(jīng)毒素，即肉毒桿菌毒素，根據(jù)其血清學(xué)性質(zhì)，分為七種血清型(A至G型)。每種毒素具有大小約150kDa的毒素蛋白質(zhì)，并且天然包含與其結(jié)合的幾種無(wú)毒性蛋白質(zhì)的復(fù)合物。中等復(fù)合物(300kDa)由毒素蛋白質(zhì)和無(wú)毒性非血凝素蛋白組成，而大復(fù)合物(450kDa)和非常大的復(fù)合物(900kDa)由與血凝素結(jié)合的中等大小的復(fù)合物組成(Sugiyama,H.,Microbiol.Rev.,44:419,1980)。已知此類(lèi)無(wú)毒性血凝素蛋白功能為保護(hù)毒素免受腸中的低pH和各種蛋白酶作用。

毒素在細(xì)胞中以具有分子量約150kDa的單一多肽合成，然后通過(guò)胞內(nèi)蛋白酶的作用或用人工酶如胰蛋白酶處理從N端末端開(kāi)始的1/3的位置處切割成兩個(gè)單元：輕鏈(L；分子量：50kDa)和重鏈(H；分子量：100kDa)。與單個(gè)多肽相比，切割的毒素具有大大增加的毒性。兩個(gè)單元通過(guò)二硫鍵彼此連接并具有不同的功能。重鏈結(jié)合靶細(xì)胞的受體(Park.M.K.等,FEMS Microbiol.Lett.,72:243,1990)，并且功能為在低pH(pH 4)與生物膜相互作用以形成通道(Mantecucco,C.等,TIBS.,18:324,1993)，并且輕鏈當(dāng)其通過(guò)使用去污劑而可滲透細(xì)胞或通過(guò)電穿孔等導(dǎo)入時(shí)具有干擾神經(jīng)遞質(zhì)分泌的藥理活性(Poulain,B.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,85:4090,1988)。

毒素抑制在神經(jīng)肌肉接頭的膽堿能前突觸處的乙酰膽堿胞吐以引起虛弱。已認(rèn)為甚至用非常少量的毒素的處理表現(xiàn)出毒性，這提示了毒素具有任何酶活性(Simpson,L.L.等,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.,26:427,1986)。

根據(jù)最近的報(bào)道，毒素具有金屬肽酶活性，并且其底物包括突觸泡蛋白(synaptobrevin)、突觸融合蛋白(syntaxin)，25kDa突觸小體相關(guān)蛋白(SNAP25)等，它們是胞吐機(jī)構(gòu)復(fù)合物的單元蛋白質(zhì)。每種類(lèi)型的毒素使用上述三種蛋白質(zhì)之一作為其底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位點(diǎn)處切割突觸泡蛋白，A和E型毒素在特定位點(diǎn)處切割SNAP25，并且C型在特定位點(diǎn)處切割突觸融合蛋白(Binz,T.等,J.Biol.Chem.,265:9153,1994)。

特別地，已知A型肉毒桿菌毒素可溶于pH 4.0-6.8的稀水溶液中。已知穩(wěn)定的無(wú)毒性蛋白質(zhì)在約7以上的pH與神經(jīng)毒素分離，并且因此毒性逐漸喪失。特別地，已知毒性隨著pH和溫度升高而降低。

肉毒桿菌毒素即使少量也是對(duì)人體致命的，并且容易大量生產(chǎn)。因此，它與炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)、鼠疫耶爾森菌(Yersinia pestis)和天花病毒(smallpox virus)一起構(gòu)成四大生物恐怖武器。然而，發(fā)現(xiàn)當(dāng)A型肉毒桿菌毒素以不系統(tǒng)地影響人體的劑量注射時(shí)，它可以使注射部位中的局部肌肉癱瘓?；谶@一特點(diǎn)，A型肉毒桿菌毒素可用于寬范圍的應(yīng)用，包括除皺劑(winkle removing agent)、治療痙攣性偏癱和大腦性癱瘓的藥劑等。因此，對(duì)A型肉毒桿菌毒素的需求已經(jīng)增加，并已經(jīng)積極開(kāi)展關(guān)于生產(chǎn)肉毒桿菌毒素的方法的研究以滿足需求。