[發明專利]一種人體血清葉酸及其代謝物串聯質譜檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201611272847.0
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN106841426A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 吳英松;董志寧;周健偉;龍允麟
• 申請（專利權）人: 廣州市達瑞生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人體血清葉酸及其代謝物串聯質譜檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括校準品、質控品、內標準液、解離劑、解離劑稀釋液、流動相A液、流動相B液、復溶液、96孔微孔板、操作說明書及其分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，適用于高效液相色譜-串聯質譜儀。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于試劑盒各組成成分及其配制方法分別如下所述：

1)校準品：使用2％～8％BSA稀釋液，同時加入一定量的葉酸、5-甲基四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸原料，配制成6個濃度劑量點的校準品，即0ng/mL、0.3ng/mL、0.9ng/mL、1.8ng/mL、5.4ng/mL、27.0ng/mL的6個濃度劑量點校準品A～F，凍干后使用；

2)質控品：使用2％～8％BSA稀釋液，同時加入一定量的葉酸、5-甲基四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸原料，配制成2個濃度的質控品，即2.0ng/mL和10.0ng/mL的C1和質控品C2，凍干后使用；

3)內標準品：使用2％～8％BSA稀釋液作為稀釋液，同時將¹³C5葉酸和d3 5-甲基四氫葉酸稀釋至終濃度為300ng/mL～600ng/mL，凍干后使用；

4)解離劑：1M DTT水溶液；

5)解離劑稀釋液：0.1M PBS緩沖液；

6)流動相A：由甲酸與純化水配制而成，甲酸的含量為0.05％～0.2％；

7)流動相B：由甲酸與乙腈配制而成，甲酸的含量為0.05％～0.2％；

8)復溶液：由乙腈與純化水配制而成，乙腈的含量為0.5％～2％；

9)96孔微孔板：由無包被的96孔深孔微孔板作為反應板和無包被的96孔微孔板作為進樣板組成，且使用耐腐蝕的聚丙乙烯材料制成。

3.根據權利要求2所述試劑盒，其特征還在于：

1)所述2％～8％BSA由含量均為0.01％的DTT、抗壞血酸和檸檬酸-水合物組成，且校準品和質控品中，優選4％濃度的BSA；

2)所述內標準品中優選2％濃度的BSA稀釋液，且優選¹³C5葉酸和d3 5-甲基四氫葉酸的濃度為400mg/mL；

3)所述流動相A和流動相B中甲酸的含量優選0.1％；

4)所述復溶液中乙腈的含量優選1％；

5)所述96孔微孔板中的反應板優選U型底，進樣板優選V型底。

4.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征還在于該試劑盒的使用包括以下步驟：

1)、準備工作液：通過以一定的比例稀釋試劑盒中的校準品、質控品、內標準品、解離劑和解離稀釋液，以滿足樣品處理所需；

2)樣品前處理：取200μL的血清樣品與一定量的解離工作液于96孔深孔微孔板中混合，37℃溫育5min；加入一定量的內標準品工作液，離心分離上清后氮氣室溫徹底吹干，加入一定量的復溶液至溶解完全；

3)移液：從步驟2)中每個板孔中將50μL/孔溶液轉移到96孔微孔板進樣板孔內；

4)設置色譜和質譜條件：根據實際儀器型號分別設置高效液相色譜和串聯質譜儀的工作參數和條件；

6)樣品檢測：將處理好的校準品、質控品和血清樣品各20μL注入高效液相色譜-串聯質譜儀進行檢測分析，并記錄色譜圖與檢測樣品中葉酸、5-甲基四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸的峰面積與內標峰面積；

7)結果分析：繪制標準曲線和計算曲線回歸方程，計算出樣品中葉酸、5-甲基四氫葉酸和5-甲酰四氫葉酸的濃度。

5.根據權利要求4所述的試劑盒使用步驟，其特征還在于：

1)所述步驟1)中具體的：將凍干的校準品和質控品用純化水溶解成工作液；按照解離劑∶解離劑稀釋液＝1∶4的比例配制成解離工作液，按照按內標準品∶乙腈＝1∶199配制成內標準品工作液；

2)所述步驟5)中的設備條件設置如下：

①色譜條件：優選Poroshell120EC-C18(4.6*50mm)色譜柱，0.6mL/min流速，40℃柱溫；

②質譜條件：優選ESI正離子MRM掃描模式，Q1/Q3離子通道分別選擇為葉酸：442.2→295.2amu，¹³C5葉酸：447.2→295.2amu；5-甲基四氫葉酸：460.3→313.3amu；¹³C5-甲基四氫葉酸，d3：464.3→317.3amu和5-甲酰四氫葉酸：474.3→327.3amu。