[發明專利]一種豬瘟病毒（CSFV）實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒

在審

• 申請號: 201611269746.8
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN108265125A
• 公開（公告）日: 2018-07-10
• 發明（設計）人: 楊勝德;孫潔;楊俊興;花群義;于明輝;居金良
• 申請（專利權）人: 上海仁度生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6806;C12Q1/6844;C12R1/93
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本發明公開了一種豬瘟病毒(CSFV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒。包括：捕獲探針、CSFV檢測引物T7引物和nT7引物、CSFV檢測探針、M?MLV反轉錄酶和T7 RNA聚合酶等試劑。本發明試劑盒能夠檢測豬臟器，排泄物，組織培養物中的RNA，具有特異性高、靈敏度高(可達100copies/反應)、污染低(擴增產物RNA在自然環境下易于降解)及快速檢測(常規50分鐘完成檢測)的特點，將在畜牧養殖業健康養殖及安全肉制品監管發揮重要作用，應用前景廣闊。

技術領域

本發明涉及病毒的生物檢測技術領域，具體涉及一種利用磁珠-RNA富集技術提取純化靶標RNA及實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術對豬瘟病毒(CSFV)進行檢測的試劑盒。通過本發明的試劑盒可實現對組織樣本，排泄物，組織培養物等樣品中CSFV核酸的檢測。

背景技術

豬瘟是由豬瘟病毒引起的一種高度接觸性傳染病，豬是該病毒唯一的自然宿主，病豬排泄物和分泌物是主要傳染源，不同年齡、性別、品種的家豬和野豬都易感，一年四季均可發生。豬瘟會導致患病豬發燒、厭食、腹瀉、死亡等，并可能帶有神經癥狀；母豬感染后可能會流產或產下死豬崽。豬瘟被世界動物衛生組織定為A類傳染病，在家豬和業主之間廣泛傳播，發達國家采取捕殺來消滅CSF，但在世界上許多國家和地區，豬瘟仍頻繁爆發，給畜牧和養殖業造成重大損失。

豬瘟病毒(CSFV)屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)，它與同屬的牛病毒性腹瀉(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)，羊邊界病毒(Border diseasevirus，BDV)存在一定的抗原交叉性，而后兩者病毒也可以感染豬，同時它們感染后的癥狀相似，血清學上不易區分CSFV與后兩者病毒，但是以核酸體外診斷為代表的基因檢測方法可以很好的區分。

目前CSFV的主要檢測方法有：病毒分離培養法、血清學檢查和RT-PCR法。病毒分離培養和血清學方法，繁雜費時，無法滿足病毒流行期間同時處理大量樣本的需要。RT-PCR法需要經歷幾十個溫度變化的循環過程，擴增反應時間長，且產物為DNA，易污染。因此，開發一種快速、靈敏、特異且不易污染的試劑盒非常必要。

實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(Simultaneous Amplification and Testing，簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法，與檢測DNA的實時熒光PCR相比，不同之處，前者檢測體系多了一個逆轉錄反應的步驟，核酸擴增在一個溫度下進行(42℃)，無需熱循環。采用M-MLV逆轉錄酶和T7 RNA聚合酶進行核酸擴增，相對于其它核酸擴增技術，反應抑制物更少，能有效減少假陰性結果。然而，SAT技術在不同種類病毒的檢測中應用所面臨的問題各不相同，需要具體分析病毒的特性進行專門設計。目前尚無針對豬瘟病毒(CSFV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術的研究報道。

發明內容

為解決現有的豬瘟病毒(CSFV)檢測方法靈敏度較低，檢測周期長、易引起擴增物的污染造成實驗結果的假陽性或假陰性以及檢測成本較高的問題，本發明提供了一種檢測周期短、高靈敏度、高特異性、低污染、反應穩定以及檢測成本低、易于推廣應用的豬瘟病毒(CSFV)實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術，包括專用引物、探針、試劑盒及其使用。

本發明所提供的豬瘟病毒(CSFV)的實時熒光核酸恒溫擴增檢測試劑盒，包含有一條可與如序列表中序列1所示的豬瘟病毒(CSFV)的靶標核酸(CSFV RNA)序列特異結合的捕獲探針，一對用于在M-MLV反轉錄酶作用下產生CSFV靶標核酸(CSFV RNA)的DNA拷貝的CSFV擴增引物T7和nT7，一條用于與在T7 RNA聚合酶作用下根據所述CSFV靶標核酸(CSFV RNA)的DNA拷貝產生的RNA拷貝特異結合的CSFV檢測探針，可與CSFV靶標核苷酸(CSFV RNA)使用同一對引物(T7和nT7)的CSFV的競爭性內標和內標檢測探針。