[發明專利]利用Xist Tale抑制性轉錄因子制備誘導性多能干細胞的方法

有效

• 申請號: 201611267083.6
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106754729B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 李喜和;張金噸;劉澎濤;王顯新;韓紅梅
• 申請（專利權）人: 內蒙古賽科星家畜種業與繁育生物技術研究院有限公司;內蒙古賽科星繁育生物技術（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用Xist Tale抑制性轉錄因子制備誘導性多能干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)細胞制備

獲取胎鼠的成纖維細胞MEF，經絲裂霉素C處理，作為誘導和培養iPSCs的飼養層；獲取Oct4-GFP MEFs；

2)獲得誘導性多能干細胞

A、Oct4-GFP MEF細胞的電轉染：當Oct4-GFP MEF細胞達到80％匯合度時，用0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液于37℃消化5min，用等量的培養液中止消化，并對細胞計數，取1×10⁶個細胞/電轉體系，以1300rpm離心5min；棄上清后用100μL電轉液重懸細胞；再將細胞移入電轉杯中，用電轉儀進行電激；向電轉杯中加入500μL提前預熱的培養液，最后將細胞懸液接種到事先準備好的鋪有步驟1)中飼養層細胞的培養皿中進行培養；上述100μL電轉液為包含1.0μg TRE-Oct4、2.0μg TRE-CKS、1.0μg轉座酶HyBase、及1.0μg CAG-rtTA的Opti-MEM培養液；在此基礎上，實驗組另外添加2.0μg結合于Xist第一內含子的Tale抑制性轉錄因子R6，R6具體的結合位點如下：TTAAGTGTTATGGACAAGGA SEQ ID NO.1，GeneBank中參考基因序列號：NC_000086.7，而對照組不添加其它載體，或者添加2.0μg無特異性結合位點的Tale抑制性轉錄因子ConR；TRE-CKS中的CKS是指c-Myc、Klf4和Sox2；

B、電轉后iPSC的誘導及建系：電轉染次日，培養液換為新鮮的添加2μg/mL Dox的M15培養液，并隔天換液；14天后，撤去Dox，換為2i培養液培養至第25-30天，至出現Oct4-GFP陽性克隆為止；第25天在熒光顯微鏡下鏡檢、計數，并拉制玻璃微針將表達Oct4-GFP陽性的細胞克隆挑出，用10μL移液槍將挑下的iPSC克隆轉入提前加入30μL 0.5g/L的胰蛋白酶-0.02％EDTA消化液的圓底96孔板中，并于37℃消化8min，吹打數次后加入等量培養液終止消化，并接種于鋪有步驟1)中飼養層細胞的平底96孔板中于37℃、5％CO2培養箱中培養，直到形成典型的iPSC克隆。

2.根據權利要求1所述的利用Xist Tale抑制性轉錄因子制備誘導性多能干細胞的方法，其特征在于，所述電轉杯為Sigma Z706086-50EA，電轉儀采用Lonza，程序A-023進行電激。