[發明專利]一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環方法

有效

• 申請號: 201611266287.8
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106501201B
• 公開（公告）日: 2018-06-19
• 發明（設計）人: 沈林;肖長河;常萍;楊小舟;余瓊林;陳帥;鄧成剛;鐘玉霞;辜振華
• 申請（專利權）人: 湖南永和陽光生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/28;G01N1/38;G01N1/34
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一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環方法，包括兩個反應物的循環反應，分別是四氫葉酸循環反應和5，10?甲基四氫葉酸循環反應；所述四氫葉酸循環反應為5?甲基四氫葉酸與L?高半胱氨酸反應生成四氫葉酸和L?甲硫氨酸后，再以四氫葉酸為反應底物與甘氨酸和NAD⁺反應生成5，10?甲基四氫葉酸和NADH；所述5，10?甲基四氫葉酸循環反應為將四氫葉酸循環反應中生成的5，10?甲基四氫葉酸為反應底物，與甘氨酸反應生成四氫葉酸和絲氨酸；通過檢測340nm波長處NADH的吸光度上升程度，測算出L?高半胱氨酸的濃度大小測定結果。該方法是以四氫葉酸為基礎產生循環反應，通過累積生成NADH放大檢測信號，在波長340nm進行測定，NADH與參與反應的同型半胱氨酸濃度成正比。

技術領域

本發明涉及生物小分子同型半胱氨酸的檢測方法技術領域，尤其是涉及一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環方法。

背景技術

同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)，或稱為高半胱氨酸，是氨基酸半胱氨酸的異種，其側鏈中含有巰基(-SH)。Hcy主要來源于飲食攝取的蛋氨酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代謝過程中一個重要的中間產物，其本身并不參加蛋白質的合成。1969年Mccully從遺傳性同型半胱氨酸尿癥死亡兒童尸檢中發現,其體循環內存在廣泛的動脈血栓形成及動脈粥樣硬化(AS)的病理表現，由此提出高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteinemia，HHCY)可導致動脈粥樣硬化性血管性疾病的假說。Hcy可以直接或間接導致血管內皮細胞損傷，促進血管平滑肌細胞增殖，影響低密度脂蛋白的氧化，增強血小板功能，促進血栓形成。

同型半胱氨酸的測定方法除了傳統的高效液相色譜法、酶免疫分析法、熒光偏振法等外，近幾年也出現了以甲硫氨酸和腺苷同型半胱氨酸為基礎的循環酶法(參見中國專利CN200480026009.4)，但由于關鍵原料的生產技術難以掌握且成本很高，難以形成市場應用。

傳統的酶免疫分析法的基本分析原理是酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定，其步驟為：先使用酶將血樣中所有形式的Hcy轉變成s-腺苷-L-Hcy,然后加入酶標的抗s-腺苷-L-Hcy的單克隆或多克隆抗體，采用競爭結合的原理，將不同水平的標準品與酶標抗體競爭結合，然后以顯色試劑和終止試劑分別進行顯色和終止，制作出hcy濃度與發色強度的標準曲線。樣品也按相同步驟處理，在標準曲線上就可以查出其Hcy的濃度。

發明內容

為了克服背景技術中的不足，本發明公開了區別于傳統測定方法和現有循環酶法的體液中同型半胱氨酸的測定方法，該方法是以四氫葉酸為基礎產生循環反應，通過累積生成還原型輔酶I(NADH)放大檢測信號，在波長340nm進行測定，NADH與參與反應的同型半胱氨酸濃度成正比。該反應中涉及關鍵酶包括：甲硫氨酸合成酶(EC 2.1.1.13)、氨基甲基轉移酶(EC 2.1.2.10)、甘氨酸羥基甲基轉移酶(EC 2.1.2.1)，用于同型半胱氨酸的循環檢測。本發明同時還公開了基于上述檢測方法的同型半胱氨酸檢測的試劑，該試劑能夠廣泛應用于臨床中同型半胱氨酸的檢測。

為了實現所述發明目的，本發明采用如下技術方案：一種用于檢測同型半胱氨酸的酶循環方法，包括兩個反應物的循環反應，分別是四氫葉酸循環反應和5，10-甲基四氫葉酸循環反應；

所述四氫葉酸循環反應為5-甲基四氫葉酸與L-高半胱氨酸反應生成四氫葉酸和L-甲硫氨酸后，再以四氫葉酸為反應底物與甘氨酸和NAD⁺反應生成5，10-甲基四氫葉酸和NADH；

所述5，10-甲基四氫葉酸循環反應為將四氫葉酸循環反應中生成的5，10-甲基四氫葉酸為反應底物，與甘氨酸反應生成四氫葉酸和絲氨酸；

通過檢測340nm波長處NADH的吸光度上升程度，測算出L-高半胱氨酸的濃度大小測定結果。