[發明專利]一種用于檢測血清甘膽酸的酶循環檢測方法

有效

• 申請號: 201611266282.5
• 申請日: 2016-12-31
• 公開（公告）號: CN106644987B
• 公開（公告）日: 2018-03-30
• 發明（設計）人: 沈林;肖長河;常萍;楊小舟;余瓊林;陳帥;鄧成剛;鐘玉霞;辜振華
• 申請（專利權）人: 湖南永和陽光生物科技股份有限公司
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種用于檢測血清甘膽酸的酶循環檢測方法，其特征是：首先進行消除樣本中內源性甘氨酸反應，然后再進行循環反應；所述循環反應為甘氨酸循環反應：

所述甘氨酸循環反應為甘膽酸在甘膽酸水解酶作用下與水反應生成甘氨酸和膽酸鹽后，再以甘氨酸為反應底物與NAD⁺和水反應生成乙醛酸和NADH；

再以乙醛酸為反應底物，與L-丙氨酸反應生成甘氨酸和丙酮酸；生成的甘氨酸又作為反應底物與NAD⁺和水反應生成乙醛酸和NADH；

然后再通過檢測340nm波長處NADH的吸光度上升程度，測算出甘膽酸的濃度大小進而得出測定結果；

所述消除樣本中內源性甘氨酸的反應過程為：甘氨酸+精氨酸→鳥氨酸+胍乙酸鹽，其反應過程中使用的酶為甘氨酸脒基轉移酶；

所述甘膽酸在甘膽酸水解酶作用下與水反應生成甘氨酸和膽酸鹽的反應過程為甘膽酸+H₂O→甘氨酸+膽酸鹽；

所述甘氨酸為反應底物與NAD+和水反應生成乙醛酸和NADH的反應過程中使用的反應酶為丙氨酸脫氫酶，其反應過程為甘氨酸+H₂O+NAD⁺→乙醛酸+NH₃+NADH+H⁺；

所述乙醛酸為反應底物與L-丙氨酸反應生成甘氨酸和丙酮酸的反應過程中使用的反應酶為醛丙氨酸氨基轉移酶，其反應過程為乙醛酸+L-丙氨酸→甘氨酸+丙酮酸；

在檢測過程中使用的試劑包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1包括緩沖液Tris、NAD⁺、精氨酸、甘氨酸脒基轉移酶、甘露醇和曲拉通X-100；所述試劑R2包括生物緩沖液Hepes、MgCl₂、L-丙氨酸、甘膽酸水解酶、丙氨酸脫氫酶、醛丙氨酸氨基轉移酶、MgCl₂、ZnCl₂、BSA和甘露醇；

所述用于檢測血清甘膽酸的酶循環檢測方法的步驟為：

S1：配制試劑R1：稱取Tris，溶解于純化水中，并用濃鹽酸調節pH至8.00±0.05；然后依次稱取甘氨酸脒基轉移酶、精氨酸、NAD⁺、甘露醇和曲拉通X-100并加入上述Tris緩沖溶液中，充分溶解后，0.22μm膜過濾，置于2～8℃備用；

S2:配制試劑R2：稱取Hepes，溶解于純化水中，并用鹽酸調節pH 至8.00±0.05，然后依次稱取MgCl₂、ZnCl₂和L-丙氨酸加入上述Hepes緩沖溶液中；然后，再分別加入甘膽酸水解酶、丙氨酸脫氫酶和醛丙氨酸氨基轉移酶到溶液中，最后加入BSA和甘露醇，攪拌至完全溶解；調節pH至8.00±0.05，0.22μm膜過濾，置于2～8℃備用；

S3：試劑測試：將步驟S1和S2中過濾后的溶液分別置于水浴平衡后得試劑R1反應液和試劑R2反應液，并配制濃度為0.05mM的5.0μmol/L的甘膽酸溶液作為檢測物；

S4：將檢測物：試劑R1：試劑R2按1:30:15比例，在生化分析儀上設定反應參數，并記錄每一讀點的吸光度，用于計算吸光度變化率。

2.如權利要求1所述的用于檢測血清甘膽酸的酶循環檢測方法，其特征是：所述試劑R1中，緩沖液Tris的濃度為20～40mM；NAD⁺的濃度為2～8mM；精氨酸的濃度為5～10mM；甘氨酸脒基轉移酶的濃度為5～15kU/L；甘露醇的濃度為30～70mM；曲拉通X-100的質量百分比為0.1％～1％。

3.如權利要求1所述的用于檢測血清甘膽酸的酶循環檢測方法，其特征是：所述試劑R2中，生物緩沖液Hepes的濃度為10～30mM；MgCl₂的濃度為2～8mM；L-丙氨酸的濃度為5～15mM；甘膽酸水解酶的濃度為2～6kU/L；丙氨酸脫氫酶的濃度為2～6kU/L；醛丙氨酸氨基轉移酶的濃度為6～10kU/L；ZnCl₂的濃度為2～10mM；BSA質量百分比為0.1％～0.9％；甘露醇的濃度為30～70mM。