[發明專利]一種固態發酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法及應用

有效

• 申請號: 201611261011.0
• 申請日: 2016-12-30
• 公開（公告）號: CN107201347B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 高兆建;張鐵柱;孫會剛;劉恩岐;李同祥;曹建冬;顧強;沈彬彬
• 申請（專利權）人: 徐州工程學院
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;A23K50/75;A23K20/189;C12R1/79
• 代理公司: 無錫萬里知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32263
• 代理人: 王傳林

1.一種嗜熱擬青霉固態發酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于：包括如下步驟：

步驟1，菌種制備：首先，在無菌條件下挑取兩環保藏的嗜熱擬青霉菌種試管孢子接種于活化斜面培養基上活化，將活化斜面培養基置于30-35℃培養箱中培養3-5天；然后，向活化好的嗜熱擬青霉斜面培養基中注入1mL無菌生理鹽水，移液槍反復吹打斜面培養基上的孢子，進一步將孢子濃度稀釋至10⁷個/mL，再取2ml稀釋后的孢子接種到裝有50g固態孢子培養基的三角瓶中，充分搖動三角瓶使孢子同培養基充分混勻，將三角瓶置于30-40℃培養箱中培養3-4天，每天翻動一次固態孢子培養基；最后，在三角瓶中裝液體種子培養基，滅菌冷卻，然后再制備成嗜熱擬青霉孢子懸液，再接種2mL的嗜熱擬青霉孢子懸液，置于旋轉式搖床上30-40℃培養1-2天，搖床轉速160-250r/min；所述嗜熱擬青霉孢子懸液的制備步驟如下：在無菌條件下，將無菌生理鹽水倒入成熟的嗜熱擬青霉麩曲中，使生理鹽水完全覆蓋固體培養基，然后將三角瓶置于磁力攪拌機上中速攪拌30min，使得充分打碎菌絲體，從而釋放孢子，然后將制備好的孢子懸液取樣在雪球計數板上計數，調節孢子濃度至1.2-1.6×108cfu/mL；

步驟2，嗜熱擬青霉三角瓶固態發酵：在三角瓶中加入固態發酵培養基100-180g，固體培養基原料初始含水率為50％，拌料水的pH為5；121℃滅菌后接入步驟1制得的嗜熱擬青霉孢子懸液2ml，32-42℃條件下培養48h，晃動三角瓶，使三角瓶培養基松散不結塊；再將溫度降低至28-37℃條件下繼續培養至96h，中間翻料2次，無菌條件下向三角瓶中添加補料營養液10-20ml，將三角瓶搖晃均勻，繼續培養至110-120h；

步驟3，嗜熱擬青霉曲盤固態發酵：在三角瓶固態發酵的基礎上進行曲盤放大試驗；將步驟2制得的嗜熱擬青霉孢子接種到裝有固態發酵培養基的曲盤中，所述曲盤固態發酵分兩階段進行，發酵第一階段，35-45℃下培養48-72h，期間翻曲1-3次；發酵第二階段，培養至72h時，向曲盤中淋加補料液體營養液30-60ml，同時培養溫度降至32-37℃，繼續培養至96h，再次向曲盤中淋加補料營養液40-80ml，培養溫度不變，培養至120-144h，結束發酵，得到粗酶液；

步驟4，葡萄糖氧化酶酶制劑制備：將步驟3所得粗酶液依次經過浸提、超濾、旋轉蒸發，得粗酶濃縮液，最后再將制得的粗酶濃縮液進行噴霧干燥，得到葡萄糖氧化粗酶劑；將超濾得到的截留液進行噴霧干燥，選用麥芽糊精作為噴霧干燥時葡萄糖氧化酶的保護劑，噴霧條件為進風溫度90-110℃、進料速度150-175mL/h、固形物含量7-12％，在此條件下，最大葡萄糖氧化酶回收率為79.8％；

所述嗜熱擬青霉的保藏編號為CGMCC No.13182。

2.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉固態發酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于：在步驟1中，所述活化斜面培養基的配方為：土豆浸出液100mL，麩皮浸出液100mL，無機鹽液1mL，蔗糖1g，瓊脂粉3g，pH5.0-6.0；固態孢子培養基配方為：麩皮5g，玉米粉1g，谷糠1g，豆餅粉2g，無機鹽溶液1mL，土豆浸出液8mL。

3.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉固態發酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于：在步驟3中，所述曲盤大小為：40cm×25cm×10cm，裝有500-1000克的固態發酵培養基，表面用四層無菌濕紗布覆蓋。

4.根據權利要求1所述的一種嗜熱擬青霉固態發酵制備耐熱耐酸葡萄糖氧化酶的方法，其特征在于：在步驟2和步驟3中，所述固態發酵培養基的配方均為：固體基質麩皮10-20g，稻殼粉5-10g、花生殼粉5-10g、玉米粉10-20g、豆粕粉5-10g、酵母粉5-8g，食用菌栽培菌渣5-6g，無機鹽液10mL，無機鹽液的起始pH為5.0，按照固液比1:1.5-1:1.1 加入pH為5.5-7.0的去離子水，混合均勻。