[發明專利]一種用于增強記憶力的血漿分離物及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201611247899.2
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106581063B
• 公開（公告）日: 2018-11-06
• 發明（設計）人: 栗琳;崔文宏;宣春玲;張麗麗;孔毅榮;郝敬雨;石浩威
• 申請（專利權）人: 北京豪思生物科技有限公司
• 主分類號: A61K35/16
• 分類號: A61K35/16;A61K47/42;A61P25/28
• 代理公司: 北京五洲洋和知識產權代理事務所(普通合伙) 11387
• 代理人: 劉春成;榮紅穎

1.一種用于增強記憶力的血漿分離物，其特征在于：來源于血漿，包括多種蛋白質和多種小分子，所述血漿分離物的FPLC鑒定具有4個峰，對應的蛋白大小分別是：30 kD、50 kD、100 kD、120 kD；所述血漿分離物的制備方法依次包括以下步驟：血漿收集、低溫過濾、低溫超濾、冷硫銨沉淀、SD滅活、陰離子交換、透析、濃縮；

在所述低溫過濾步驟中，在壓力條件下將所述血漿進行過濾，得到濾液，所述過濾采用的濾膜的孔徑為0.22微米或0.45微米；

在所述低溫超濾步驟中，將所述濾液通過施加壓力進行膜包超濾，得到低溫超濾產物；所述膜包截留分子量為3kD-10kD；所述超濾的溫度為0-4℃，壓力為1-20MPa；所述超濾使用的緩沖液為磷酸鹽緩沖液、Tris-鹽酸緩沖液、HBS緩沖液中的一種；所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為1-100 mM、pH值為8.0，所述磷酸緩沖液的濃度為20 mM、pH值為8.0，所述HBS緩沖液的濃度為250mM、pH值為7.0；

在所述冷硫銨沉淀步驟中，將所述低溫超濾產物與預冷的飽和硫銨溶液混合后靜置，得到冷硫銨沉淀產物；所述預冷的溫度為0-4℃；所述飽和硫銨溶液和所述低溫超濾產物的體積比為1：（1-6）；所述靜置溫度為0至 10℃；

在所述SD滅活步驟中，將所述冷硫銨沉淀產物用SD滅活劑重新懸浮后靜置，靜置后進行離心處理，保留上清液，作為SD滅活產物；所述靜置溫度為4~37℃，時間為6~24小時；所述SD滅活劑含有0.3~2% 的N-丁基三磷酸鹽、0.5~2%的吐溫；所述離心處理中，離心力為2000-8000g，時間為10-30分鐘，溫度為0-4℃；

在所述陰離子交換步驟中，將所述SD滅活產物加入陰離子交換柱中采用洗脫緩沖液進行梯度洗脫，收集洗脫液得到陰離子交換產物，其中，所述洗脫緩沖液為含有300-500mM氯化鈉的Tris-鹽酸緩沖液，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為0.2-200mM、pH值為8.0-9.2，開始收集洗脫液時的洗脫體積為35ml，停止收集洗脫液時的洗脫體積為45ml；

在所述透析步驟中，將所述陰離子交換產物進行透析，收集透析容器中的產物得到透析產物；所述透析采用的緩沖液為Tris-鹽酸緩沖液或者HBS緩沖液，所述Tris-鹽酸緩沖液的濃度為1-75 mM、pH值為8.0，所述HBS緩沖液的濃度為175mM、pH值為7.5，所述透析的時間為20-72h；所述透析的體積比是1：（100-10000）；

在所述濃縮步驟中，將所述透析產物進行濃縮，得到濃縮產物，即為所述血漿分離物；所述濃縮是采用濃縮管離心或者采用濃縮杯加壓，所述濃縮管或者所述濃縮杯允許1.0-3.0KD的物質通過。

2.根據權利要求1所述的用于增強記憶力的血漿分離物，其特征在于：所述血漿分離物的SDS-PAGE變性膠電泳至少包括7條條帶，所述條帶的分子量為：25 kD、55 kD、69 kD、72kD、75 kD、80 kD、190 kD。

3.根據權利要求1所述的用于增強記憶力的血漿分離物，其特征在于：通過蛋白質譜分析，所述血漿分離物中至少含有如下56種蛋白：蛋白IGKV1-8、基膜聚糖、血漿銅藍蛋白、蛋白S100-A8、補體因子H、細絲蛋白-A、載脂蛋白A-I、半乳糖凝集素結合蛋白、免疫球蛋白muC鏈、延長因子1-α1、凝溶膠蛋白、過氧化物酶1、維生素D結合蛋白、甲基轉移酶TARBP1、結合珠蛋白、G蛋白偶聯受體G2、蛋白IGKV3D-20、星形肌動蛋白2、C4b結合蛋白α鏈、半胱天冬酶14、激肽原1、細胞周期蛋白J、補體C7、忒絲蘭素、α-1抗胰凝乳蛋白、蘋果酸脫氫酶、抗凝血酶III、阿片型生長因子受體蛋白1、補體C8β、卷曲螺旋蛋白144 c、蛋白IGKV1-6、SCL中斷位點蛋白、補體H因子相關蛋白1、通用轉錄因子II-I重復結構域蛋白2A、載脂蛋白A-II、真核翻譯起始因子2α激酶3、蛋白IGKV2D-29、脂肪酰輔酶A還原酶1、羧肽酶N亞基、線粒體upf0317蛋白、凝血因子XII、解旋酶DNA結合蛋白8、補體因子I、類HHAT蛋白、激肽釋放酶結合蛋白、分裂增強子、皮質類固醇結合球蛋白、蘭尼堿受體1、無花果酶3、神經纖毛蛋白-1、激肽釋放酶、解旋酶Senataxin、補體C8α、酸性二肽酶樣蛋白2、性激素結合球蛋白、蛋白IGLV2-8。