[發明專利]一種提高蛹蟲草液態發酵生產蟲草素和耐熱蛋白酶產量的方法

有效

• 申請號: 201611245510.0
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN107058119B
• 公開（公告）日: 2020-03-17
• 發明（設計）人: 高兆建;楊杰;孫會剛;曹澤虹;曹建冬;沈彬彬;顧強;康志鋒
• 申請（專利權）人: 徐州鴻宇農業科技有限公司
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12N9/58;C12P19/40;C12R1/645
• 代理公司: 宿遷市永泰睿博知識產權代理事務所(普通合伙) 32264
• 代理人: 彭娟

1.一種蛹蟲草菌株，其特征在于：該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，保藏編號為：CGMCC No. 13179。

2.一種提高蛹蟲草發酵液中蟲草素和耐熱蛋白酶產量的方法，包括：

步驟1 液體發酵蛹蟲草菌種的制備

（1）蛹蟲草斜面菌種的制備：

將權利要求1保藏的蛹蟲草菌株在PDA斜面培養基上進行活化，22~28℃下黑暗培養4~6天，待菌絲長滿培養基平面即完成；

（2）蛹蟲草三角瓶液體菌種的制備：

先將上述制備好的斜面培養基上的活化好的菌種取1塊6~10平方毫米大小的菌苔接入裝有50~80ml種子培養基的250ml三角瓶中，在24~27℃、振蕩器轉速為180~220r/min恒溫振蕩器上發酵2~4天，形成微小的菌球；

步驟2 液體菌種發酵生產蟲草素

包括：三角瓶液體發酵和發酵罐液體發酵，所述三角瓶液體發酵為：按照接種量8%～15%的接種量將步驟1中培養好的蛹蟲草三角瓶液體菌種接入已滅菌的裝有100～300mL液體發酵培養基的1000mL三角瓶中進行發酵，包括：

發酵前期：溫度為25～28℃，搖瓶轉速為160～180r/min，發酵1~2天；

發酵中期：溫度為28～32℃，搖床轉速調整為180～210 r/min，發酵3~5天；

發酵后期：溫度為24～28℃，發酵7~12天，發酵至5天時，將滅過菌的補充營養液60～120ml，倒入以上三角瓶中，營養液的pH值為5.5，同時補加蟲草素復合激活劑使發酵液中激活劑總量的濃度達到0.5～1.2g/L，接著繼續震蕩發酵培養，發酵時間達到7～12天時，發酵終止；所述發酵罐液體發酵，分為：（1）發酵前期準備發酵罐分為7.5L發酵罐或20L發酵罐：在7.5L發酵罐中加入4.0~5.0L液體發酵培養基，關閉各閥門通入蒸汽進行實罐滅菌，滅菌操作完成后開循環水閥門降溫，待溫度降至25~28℃后打開罐口以8~12％接種量倒入步驟1中培養好的蛹蟲草三角瓶液體菌種，罐壓0.03~0.05Mpa，進入發酵操作；在20L發酵罐中加入12~15L液體發酵培養基，關閉各閥門通入蒸汽進行實罐滅菌，滅菌操作完成后開循環水閥門降溫，待溫度降至25~28℃后打開罐口以10~14％接種量倒入步驟1中培養好的蛹蟲草三角瓶液體菌種，罐壓0.03~0.05Mpa，進入發酵操作；

（2）發酵

發酵前期：溫度28~32℃，攪拌器轉速為200~400轉/分，通氣量1.3~1.8L/(L·min)，發酵1~2天，發酵液pH值維持在5.0~6.0；

發酵中期：溫度28~32℃，發酵3~5天，發酵液pH值維持在5.5~6.5；

發酵后期：溫度為24～28℃，發酵7~12天，發酵液pH值維持在5.5~6.5；

發酵進行到5天開始補料，補料采取流加的方式，每天流加補充營養液為發酵液總體積的15~20％，到發酵10天時，停止流加補充營養液；

蟲草素復合激活劑補加方式如下：從發酵第5天開始，每天補加復合激活劑，每次補加的量是發酵液中復合激活劑終濃度達到：1~2g/L，發酵第10天時，補加最后一次復合激活劑。

3.根據權利要求2所述一種提高蛹蟲草發酵液中蟲草素和耐熱蛋白酶產量的方法，其特征在于：所述步驟2中液體發酵培養基的配制方法為：可溶性淀粉20~30g、葡萄糖10~20g、大豆蛋白胨10~15、硫酸銨5~8g、酵母提取物5~8g、KH₂P0₄ 1~2g、MgS04·7H₂0 0.5~1g、ZnS0₄·7H₂0 0.05~0.1 g、FeS0₄·7H₂0 0.02~0.05g、VB₁ 0.1~0.5g，加水定容至1L，pH 6.5~7.0，121℃溫度下滅菌20min，23~26℃ 160~180r/min震蕩培養4~8天。