[發明專利]一種快速創制轉基因玉米雙單倍體純合后代的方法

在審

• 申請號: 201611244164.4
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106613985A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 邸宏;周羽;曾興;王振華;祖紅月
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 成都環泰知識產權代理事務所(特殊普通合伙)51242
• 代理人: 鄧瑞

1.一種快速創制轉基因玉米雙單倍體純合后代的方法，其特征在于：包括

試驗材料：玉米單倍體誘導系東誘1號、L7和JY3，為東北農業大學農學院玉米課題組選育，具有R-nj標記；用于創建單倍體的F1雜交種，其母本為轉玉米精氨酸酶ZmARG基因玉米HiII的T2代株系，父本為合344；上述常規玉米材料公眾可從東北農業大學農學院玉米課題組獲得；

試驗方法：

材料的種植：采用隨機區組設計，3次重復，雙行區，行長5m，株距30cm，行寬70cm，每行17株；兩地田間管理標準一致，同普通玉米生產田；5米行長，株距30cm，行距70cm；雜交種一次播種，時間為當年4月29日，誘導系分3期播種，時間分別為當年4月29日，5月7日和5月11日；

授粉：用誘導系給F1雜交種授粉，掛牌記錄授粉時間，每個誘導系至少授10株；

組織培養的試驗流程：

培養基：

(1)篩選培養基：MS液體培養基+100uM ABA；

(2)加倍培養基：MS液體培養基+2mg/L天冬酰胺+1mg/L BAP+0.05％的秋水仙素；

(3)生長培養基：MS固體培養基；

操作方法：

(A)幼穗的消毒

分別在授粉后18d，20d取幼穗，剝去苞葉，在75％乙醇中滅菌8min，0.1％HgCl₂消毒6min，無菌水沖洗3次；

(B)幼胚的剝取：

取幼胚，盾片朝下置于培養皿中用篩選培養基浸潤的無菌濾紙上，28℃，16h光照/8小時黑暗，培養24h；

(C)單倍體幼胚的加倍：

挑選出盾片無色素沉著的單倍體幼胚，盾片朝上接種到培養皿中用加倍培養基浸潤的無菌濾紙上，26℃黑暗培養24h；

(D)幼胚培養：

將幼胚轉移至生長培養瓶中，盾片向下，26℃暗培養1周，之后26℃光培養2-3周直至根發育完全；每瓶接種15個左右；

(E)移栽：

將小苗移栽至土壤基質中，溫室內培養，根據葉鞘顏色鑒別單倍體植株，直至成熟，嚴格自交，收獲種子；

(F)雙單倍體的PCR檢測：

采用CTAB小量法提取玉米幼苗葉片的總DNA；由于ZmARG基因為玉米內源基因，根據啟動子Ubi序列和目的基因序列設計引物，引物ARG-F位于啟動子Ubi序列內部，引物ARG-R位于目的基因序列內部，產物大小為775bp；篩選標記基因為抗除草劑草甘膦基因，產物大小為522bp；引物序列如下：

ARG-F:5’-CGCCCTTCTTTGGTGAT-3’

ARG-R:5’-CCCTGCCTTCATACGCT-3’

PCR反應程序為，94℃5min，94℃30s，60℃30s，72℃1min，72℃8min，32個循環；1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴增產物；

數據統計方法:

單倍體的誘導率＝單倍體幼胚數/接種幼胚數*100％；加倍率＝結實株數/再生苗數*100％；采用Excel 2010對試驗數據進行初步整理，使用統計分析軟件SPSS Statistics 17.0中獨立樣本T檢驗和方差分析程序進一步分析。

2.根據權利要求1所述的快速創制轉基因玉米雙單倍體純合后代的方法，其特征在于：所述步驟(E)中的葉鞘顏色鑒別單倍體植株的葉鞘顏色為綠色葉鞘。

3.根據權利要求1所述的快速創制轉基因玉米雙單倍體純合后代的方法，其特征在于：所述步驟(E)中自交時，如果散粉困難，需要用針挑破花藥釋放花粉。