[發明專利]靶向survivin納米抗體及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201611243867.5
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106632607A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 馬興元;張娜;吳東;鄭文云;郭華;胡發彪
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C07K7/08;C07K16/32;A61K39/395;A61K38/16;A61P35/00
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務所(普通合伙)31218
• 代理人: 翟羽

技術領域

本發明涉及生物技術藥物領域，更具體地講，涉及一種利用七肽和十二肽作為互補決定區的非保守序列的納米抗體的設計構建和制備方法。

背景技術

肝癌是世界上發病率最高的惡性腫瘤之一。據報道，每年全球范圍內的肝癌新發患者數量多達約75萬，中國占其中的55％。目前治療主要有手術切除、放射治療和化學藥物治療。這些療法對早期肝癌可獲得較滿意的效果，但對晚期肝癌且伴有局部擴散和遠處轉移者，療效往往較差。而身體對放療和化療不良反應較大，放療和化療在殺傷腫瘤細胞的同時，對正常組織細胞也有影響。

生物靶向治療是以腫瘤細胞過度表達的某些標志性分子為靶點，選擇針對性地阻斷、干預受該標志性分子調控和密切相關的信號傳導通路，從而達到抑制腫瘤生長、進展及轉移的效果。生物靶向治療具有較好的分子選擇性，能選擇性、高效地殺傷腫瘤細胞，減少對正常組織的損傷。同時，為避免腫瘤細胞對藥物產生耐藥性，現在有越來越多的治療策略是關于靶向凋亡抑制因子的，survivin就是其中之一。

Survivin是已知的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中最小的成員(142個氨基酸殘基)，它的大小約為16.5kDa。與其他IAP家族成員的結構相比，survivin的結構較特殊：其他IAP家族成員的N末端是2-3個包含70個氨基酸殘基的桿狀病毒IAP重復序列(BIR)，C末端是一個鋅指環的結構；而survivin的N末端是一個鋅結合BIR域，C末端是一個長的α螺旋。單拷貝的survivin基因有六種剪接體，除了野生型的含3個內含子，4個外顯子的survivin，還有五個survivin剪接體，分別為在外顯子2和3之間插入69個堿基的survivin-2B，缺失一個外顯子的survivin-△Ex3，隱藏于內含子3內的外顯子3B取代外顯子4的survivin-3B，由外顯子1,2和來源于內含子2組成的survivin-2α，以及由外顯子1,2和來源于內含子3組成的survivin-3α，這些survivin剪接體的轉錄和翻譯已經被很多研究者證實了，這些剪接體在哺乳動物細胞的表達量要遠高于正常組織。

在駱駝體內不僅存在著傳統的四鏈抗體，還存在著天然缺失輕鏈的重鏈抗體(HCAb)。所有的駱駝科動物體內都存在重鏈抗體，但在其他偶蹄類動物中則沒有發現重鏈抗體，重鏈抗體是由一個可變區域(variable domain，VHH)和兩個恒定區域(constant domain，CH2和CH3)組成的，雖然它是天然缺失輕鏈以及重鏈的恒定區CH1的，但是重鏈抗體仍然具有可以與單克隆抗體可比擬的抗原結合力。更重要的是，單獨克隆與表達重鏈抗體可變區，得到可以穩定存在并可以獨立結合抗原的VHH抗體，由于VHH抗體的大小是在納米級(直徑2.5nm，高4nm)，因此VHH抗體也稱為納米抗體(Nb)。到目前為止，納米抗體是已知最小的抗原結合片段、。

目前，獲取特異性納米抗體主要有兩種方法，最為常用的方法是用特異性蛋白或者表達該種蛋白的細胞免疫駱駝科動物，使其大量產生重鏈抗體。隨后，收集外周血淋巴細胞，用噬菌體展示技術構建特異性納米抗體文庫，再進行篩選鑒定，通過免疫駱駝科動物構建納米抗體噬菌體文庫能夠保持納米抗體功能多樣性的完整，同時這也是一種簡單而直觀的過程，可以在較短的時間內獲取高親和力的特異性納米抗體。然而，在有些條件下，這種方法是很難進行的，如：當抗原是具有高毒性和致病性的，是錯誤折疊的包涵體，是自我免疫抗原，或者是一些無免疫性的小分子化合物時，構建經免疫的納米抗體噬菌體文庫是非常困難的。在這種情況下，天然納米抗體噬菌體文庫是另外一種可選的方法，理論上它是可以跳過免疫而直接淘選出靶向任何抗原的特異性納米抗體，然而，在已經報道的納米抗體噬菌體文庫庫容量是1.6×10⁵-5×10⁹colony-forming units(CFU)/mL，較小的庫容量加之非經免疫特異性不強，以及受到自身免疫耐受和所接觸抗原的限制，因此很難篩選到高親和力的納米抗體。基于此，我們充分利用納米抗體的結構：保守的框架區與非保守的決定其特異性的互補決定區，嘗試一種新型的獲取對survivin具有特異性親和力的納米抗體的方法。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供與survivin具有高親和力的多肽組合。

本發明的第二個目的在于提供與survivin具有高親和力的多肽組合在制備靶向survivin納米抗體中的應用。

本發明的第三個目的在于提供靶向survivin納米抗體的制備方法。