[發(fā)明專利]雌三醇均相酶免疫檢測試劑、制備方法及檢測方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201611243251.8 | 申請日： | 2016-12-29 |
| 公開（公告）號： | CN106645692B | 公開（公告）日： | 2018-05-11 |
| 發(fā)明（設計）人： | 朱雪明;虞留明 | 申請（專利權）人： | 蘇州博源醫(yī)療科技有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/535 | 分類號： | G01N33/535;G01N33/543 |
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| 地址： | 215163 *** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 雌三醇 均相 免疫 檢測 試劑 制備 方法 | ||
1.一種雌三醇均相酶免疫檢測試劑的制備方法，其特征在于：
所述的雌三醇均相酶免疫檢測試劑含有抗雌三醇特異性抗體和指示試劑；
所述的抗雌三醇特異性抗體為由雌三醇免疫原免疫實驗動物后產(chǎn)生的完整抗體分子，或者為保留與雌三醇特異性結合能力的抗體片段或抗體衍生物；
所述的雌三醇免疫原，其結構式如式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）
載體為具有免疫原性的蛋白質(zhì)或多肽；
所述的指示試劑為由雌三醇酶標偶聯(lián)物和酶的底物組成的酶試劑，酶標偶聯(lián)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原酶標偶聯(lián)物，酶的底物為葡萄糖-6-磷酸；
所述的雌三醇均相酶免疫檢測試劑分為試劑A和試劑B；
所述的雌三醇均相酶免疫檢測試劑的制備步驟為：
（1）試劑A：將2.018～8.072g、5.625～22.50 mM氧化態(tài)的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和0.856～3.422g、5.625～22.50 mM葡萄糖-6-磷酸用0.5～2 L 55 mM、pH=8.0的Tris緩沖液溶解制成均相酶底物；將抗雌三醇特異性抗體加到上述均相酶底物中，抗雌三醇特異性抗體與均相酶底物的體積比為1: 200～1:7500；
（2）試劑B：將雌三醇酶標偶聯(lián)物加到120mM、pH=8.2的Tris緩沖液中，雌三醇酶標偶聯(lián)物與Tris緩沖液的體積比為1:200～1:7500；
其中，雌三醇酶標偶聯(lián)物的制備方法包含以下步驟：
（a）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液的制備：稱取7.5～22.5 mg規(guī)格為100KU的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶，室溫溶解于6～18 mL含有 72.6 mg 0.05 M Tris、8mg 3.3 mM MgCl
（b）雌三醇衍生物的激活：在無水狀態(tài)下稱取5～15 mg 雌三醇衍生物，溶解于300～900 μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液溫度降到 -10 ~ -14℃；加入1.5～4.5 μL 三丁胺；加入0.75～2.25 μL氯甲酸異丁酯；加入0.1～2 μL 碳二亞胺EDC；5～15mg N-羥基硫代琥珀酰亞胺；-10 ~ -14℃攪拌30～60分鐘；
（c）葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與雌三醇衍生物的連接：將步驟（b）激活的溫度為-10 ~ -14℃的雌三醇衍生物溶液逐滴加入到步驟（a）溶解的溫度為30-35攝氏度的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶溶液中；2-8℃攪拌過夜；
（d）純化產(chǎn)物：通過G-25凝膠層析柱純化連接產(chǎn)物，獲得的最終產(chǎn)物為葡萄糖-6-磷酸脫氫酶-半抗原偶聯(lián)物，于2-8℃下儲存；
所述的雌三醇衍生物結構式如式（Ⅱ）所示：
式（Ⅱ）。
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