[發明專利]一種小麥耐鹽蛋白及其應用

在審

• 申請號: 201611243045.7
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106834302A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 王萌;施衛明
• 申請（專利權）人: 中國科學院南京土壤研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C07K14/415;A01H5/00
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司32200
• 代理人: 唐循文

技術領域

本發明屬于生物基因工程技術領域，尤其涉及耐鹽蛋白及其應用。

背景技術

土壤鹽漬化嚴重影響農作物產量。特別是隨著工業的發展，土壤鹽漬化愈來愈嚴重，已成為一個全球關注的社會問題。我國人口眾多，而土壤鹽漬化更為嚴重，已經成為制約我國經濟和社會發展的重要因素。因此，除了緩解土壤鹽漬化以外，培育耐鹽農作物新品種已成為當前一個十分迫切的任務。

利用轉基因改良植物技術將新的性狀轉入高生物量植物中，以此開發高效的轉基因植物新品種并用于在鹽堿地種植，是一項具有廣闊應用前景的技術。

目前，利用基因工程技術開展植物耐鹽方面研究已取得了較大的進展，克隆了大量相關基因，并將這些基因轉入植物中，用于耐鹽機制研究。一些實驗表明，將植物本身以及其它生物中與耐鹽相關的基因轉入植物中，其異源轉錄和翻譯產物可以使轉基因植物的抗鹽能力得到提高。

發明內容

解決的技術問題：本發明的目的是提供一種小麥耐鹽蛋白和其在植物耐鹽性狀改良中的應用

技術方案：一種小麥耐鹽蛋白，所述氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

編碼所述小麥耐鹽蛋白的基因，序列如SEQ ID No.1所示。

一種含有上述基因的植物表達載體。

上述基因在培育抗鹽植物中的應用。

優選的，所述植物是普通小麥。

上述植物表達載體在培育抗鹽植物中的應用。

有益效果：利用植物基因工程技術，本發明克隆得到了一種小麥耐鹽蛋白及其編碼基因，并首次將該基因轉入普通小麥中，經過比較分析證明，轉基因植株的耐鹽能力明顯提高，預示其可廣泛用于培育耐鹽農作物品種，尤其是在培育耐鹽小麥品種中將有重要作用。

附圖說明

圖1為耐鹽基因全長cDNA序列的擴增結果；

圖2為轉載體小麥陽性系的鑒定圖，其中“-”為陰性對照，“+”為陽性對照；

圖3為鹽脅迫對轉基因小麥株系與對照株系根系生長的影響。

具體實施方式

實施例1、耐鹽基因的克隆

1.1提取小麥Total RNA

1.將組織材料放入液氮預冷的研缽中，在液氮中充分研磨成粉末；

2.待液氮揮發干，立即轉移到2mL的離心管中，每100mg材料約加入1mL的Invitrogen公司的TRIzol提取液，融化后，用加樣槍反復吸吹，劇烈振蕩混勻樣品，使樣品充分裂解，室溫放置5分鐘；

3.加入0.2mL氯仿，劇烈振蕩混勻15秒，室溫放置10分鐘；

4.4℃，12000rpm離心15分鐘；

5.用移液器小心吸出上層水相，加入新的1.5mL的離心管中，加入500μL的異丙醇(1:1體積)，充分混勻，-20℃，沉淀30min或過夜；

6.4℃，12000rpm離心10min，小心棄去上清液；

7.RNA沉淀用1mL的75％乙醇洗滌。4℃，8000rpm離心10min收集沉淀；

8.重復用75％乙醇洗滌一次RNA沉淀；

9.去上清，RNA沉淀于無菌操作臺上晾干約10-15分鐘，RNA略顯透明，加入適當體積(30-50μL)的RNase-free水充分溶解(可放于-80℃長期保存)；

10.紫外分光光度計及1％Agrose凝膠電泳檢測RNA濃度及質量。

1.2cDNA反轉錄

反轉錄酶：M-MLV Reverse Transcriptase(Invitrogen)。

2.65℃變性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:

5×First-Strand Buffer 4μL

0.1M DTT 2μL

RNase(Invitrogen)1μL

3.輕輕混勻，37℃反應2min；

4.加入1μL M-MLV RT，混勻，37℃反應50min；

5.70℃溫育15min使M-MLV RT失活；

6.加入1μL RNase H(Invitrogen)，37℃反應20min；

7.用超純水稀釋至合適濃度。作為PCR模板。

1.3開放閱讀框的克隆和序列測定

1.引物序列：根據測序結果，設計基因上下游引物:HKT-B2-F(GAAGTCTCTAGAATACTTGCAGTAG)，HKT-B2-R(GTCTGCTACTAGGTTATACTATCAT)，擴增基因的開放閱讀框。