[發明專利]一種合成含有分子內二硫鍵的多肽的新工藝

在審

• 申請號: 201611242844.2
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN108250265A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 張新軍;王振亞;高亮;鄭頔;丁歡;肖凌云
• 申請（專利權）人: 北京中科亞光生物科技有限公司
• 主分類號: C07K1/20
• 分類號: C07K1/20;C07K1/06;C07K1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于多肽化學合成技術領域，特別涉及含有分子內二硫鍵的多肽的合成方法。此方法包括一種直接對線性多肽粗品的反相高效液相色譜純化組分進行氧化的策略，在這種策略中，首先對多肽線性粗品通過反相高效液相色譜進行純化，得到的純化組分直接進行氧化。氧化多肽溶液通過濃縮后再次通過反相高效液相色譜進行純化，最終經冷凍干燥后得到目標多肽的純品。此方法有效避免了多肽線性粗品中某些雜質對氧化產物純度的干擾，可有效提高最終產物的純度和綜合收率。與常規合成方法相比生產流程得到了簡化，避免了多肽的反復冷凍干燥和溶解過程，在更好的保護多肽產品品質的同時，提高了分子內二硫鍵多肽大規模生產的可行性。

技術領域

本發明關于一種制備序列中含有分子內二硫鍵的多肽的新方法，尤其適用于線性多肽合成效果不佳、對最終產品純度要求較高并有大規模生產需求的多肽序列，和用這種方法得到的產物。

背景技術

多肽是由多種氨基酸按照一定的排列順序通過肽鍵結合而成的一類化合物，其分子結構介于氨基酸和蛋白質之間，是涉及生物體內各種細胞功能的生物活性物質。多肽的全合成不僅具有很重要的理論意義，而且具有重要的應用價值。通過多肽全合成可以驗證一個新的多肽的結構；設計新的多肽，用于研究結構與功能的關系；為多肽生物合成反應機制提供重要信息；建立模型酶以及合成新的多肽藥物等。并且，從動物、植物和微生物等生物體中分離提取多肽極受來源的限制，多肽的化學合成則具有更光明的工業化前景。近年來對多肽研究的熱點已轉移到環肽的合成和生物評價上，而通過二硫鍵形成環肽是非常方便的一種途徑,。在許多重要的胞外多肽和蛋白質分子如包括激素、酶、生長因子、毒素、免疫球蛋白，二硫鍵在分子折疊和穩定結構方面發揮著至關重要的作用。而且，人為地引入一些二硫鍵可以對多肽或蛋白質的構象進行進一步約束，可以達到提高其生物活性或熱力學穩定性的目的。也正是由于這類大分子環肽具有相對明確的特定構象，所以他們能夠更好地與受體進行選擇性結合，其代謝穩定性和生物利用度遠遠高于直鏈肽。鑒于以上二硫鍵的這些優勢，含有二硫鍵的多肽的化學合成長期以來一直引起科學家的廣泛興趣。

對于多肽分子內二硫鍵來說，構象方面的因素如多肽鏈長度、二硫鍵間氨基酸殘基的種類及個數等對二硫鍵形成的難易程度影響尤其重要；而生產工藝的選擇，如合成中半胱氨酸(Cys)側鏈巰基保護基團、氧化條件以及純化工藝的選擇等，也對二硫鍵多肽的生產效率影響顯著。通常的合成工藝中，主要采用三苯甲基(Trt)或乙酰氨甲基(Acm)作為半胱氨酸的側鏈巰基保護基團，通過傳統Fmoc/tBu固相合成法合成直鏈肽,再經碘(I2)或者二甲亞砜(DMSO)氧化肽鏈上兩個半胱氨酸的巰基，生成分子內二硫鍵而得到目標環肽。線性肽成環屬于分子內反應，為避免發生分子間反應生成線性或環狀的二聚和多聚體，一般在高度稀釋的溶液(10^-3～10^-4mol/L)中進行。近年來也有在固相中成環的報道，即在完成整個多肽鏈的合成后不進行切割直接在樹脂上進行氧化成環，利用的是固相材料的“假稀釋”作用來避免分子間的二聚和多聚副反應，此策略的優勢在于不需要在高度稀釋的溶液中進行氧化，并且過量的氧化試劑及某些小分子副產物可通過洗滌與過濾除去。但是這種策略中，進行切割時切割試劑的選擇會受限于多肽中二硫鍵的存在，導致一些氨基酸殘基存在發生副反應的風險，從而使得粗肽純度降低，最終將影響純化收率以及終產物的純度。所以在多肽生產中，多肽在溶液中進行氧化仍是制備二硫鍵多肽的主要方法之一。