[發(fā)明專利]一種從發(fā)酵液中分離純化環(huán)孢菌素A的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611241709.6
• 申請(qǐng)日: 2016-12-29
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108250275A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-07-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 聞建華;聞銘遠(yuǎn);傅紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津領(lǐng)世生物科技開(kāi)發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): C07K7/64
• 分類號(hào): C07K7/64;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/14
• 代理公司: 天津盛理知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12209
• 代理人: 韓曉梅

本發(fā)明提供一種從發(fā)酵液中分離純化環(huán)孢菌素A的方法，包含以下步驟：(1)環(huán)孢菌素A的提取；(2)大孔吸附樹(shù)脂層析；(3)PS30RPC型聚合物納米微球柱層析；(4)結(jié)晶純化洗脫液真空濃縮并結(jié)晶，用冷丙酮石油醚洗滌，最后真空干燥得無(wú)色粉末狀環(huán)孢菌素A純品。本發(fā)明方法經(jīng)發(fā)酵液提取、非極性大孔吸附樹(shù)脂層析、PS30RPC型聚合物納米微球柱層析、結(jié)晶純化得純度大于98.5％環(huán)孢菌素A，收率為70％以上。本發(fā)明采用等濃度洗脫，沒(méi)有復(fù)雜的中間步驟溶劑置換過(guò)程，工藝操作簡(jiǎn)捷，適于工業(yè)化生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種環(huán)孢菌素A的分離純化工藝。

背景技術(shù)

環(huán)孢菌素A(Ciclosporin A，CsA)是從多孔木霉(Tolypocladium inflatumCSP3)，后正名為雪白白僵菌(Beauveria bassiana)的培養(yǎng)物中分離得到的一種含11個(gè)氨基酸的環(huán)狀多肽，是一種作用很強(qiáng)的免疫抑制劑，除了環(huán)孢菌素A外還有B、C、D等20多種同系物。環(huán)孢素A用于腎臟、肝臟和心臟等移植手術(shù)的免疫抑制治療，它還可以用來(lái)治療一些自身免疫疾病，如紅斑狼瘡、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、特發(fā)性血小板減少性紫癜、潰瘍性結(jié)腸炎、重癥肌無(wú)力、慢性腎炎、慢性活動(dòng)性肝炎和腎病綜合癥等多種自身免疫性疾病。

環(huán)孢菌素A發(fā)酵產(chǎn)品中的主要雜質(zhì)是結(jié)構(gòu)相似的環(huán)孢菌素A同系物，包括B、C、D等，現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)于環(huán)孢菌素A的提取純化主要工藝路線是先用有機(jī)溶劑提取，然后通過(guò)不同類型的柱層析進(jìn)行分離純化。

CN200510108097.9描述了一種首先得到環(huán)孢菌素粗晶體，再利用柱層析分離純化環(huán)孢菌素A，并進(jìn)行二次結(jié)晶的純化工藝，該方法粗結(jié)晶工藝復(fù)雜，使用有機(jī)溶劑種類多，有些溶劑價(jià)格較貴，而且結(jié)晶需要3天，整個(gè)純化工藝耗時(shí)長(zhǎng)。US5656459公開(kāi)了一種提取純化工藝，先用甲醇提取，去除甲醇再將提取物溶于乙酸乙酯，通過(guò)兩次硅膠柱層析獲得環(huán)孢菌素A純品，該工藝提取與硅膠層析所用溶劑不能銜接，需要轉(zhuǎn)換，而且硅膠層析次數(shù)多，總收率低。

US5382655公開(kāi)了一種用氯仿、二氯甲烷和乙醇作為流動(dòng)相分離純化環(huán)孢菌素A的硅膠柱層析方法，但這些溶劑毒性大，對(duì)環(huán)境不友好。專利US597638公開(kāi)了一種利用高壓二氧化碳作為流動(dòng)載體通過(guò)硅膠柱層析獲得環(huán)孢菌素A的方法，但該方法對(duì)設(shè)備要求高，樣品處理量少，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模規(guī)模化生產(chǎn)。專利US2002/0162789A1公開(kāi)了一種用多步硅膠色譜分離，流動(dòng)相甲苯和乙酸乙酯，主要缺點(diǎn)是甲苯毒性大，色譜步驟多，溶劑耗量大。WO01/64935A1描述了一種利用有機(jī)溶劑提取、凝膠過(guò)濾和硅膠柱層析分離純化環(huán)孢菌素A的方法，該方法主要缺點(diǎn)是凝膠過(guò)濾填料價(jià)格昂貴，而且各個(gè)步驟間都需將前一步的溶劑去除，工作量大，溶劑消耗多。US2003/0186856A1采用葡聚糖凝膠通過(guò)兩次層析分離純化環(huán)孢菌素A的方法，主要問(wèn)題是填料價(jià)格貴，成本高。CA2108655提供了一種采用超流體萃取技術(shù)分離環(huán)孢菌素A的方法，該方法投資大，成本高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。

綜合公開(kāi)專利的主要特點(diǎn)是先用有機(jī)溶劑進(jìn)行萃取，然后利用一步或多步硅膠柱層析進(jìn)行分離純化，有些分離純化工藝成本高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)，有些工藝溶劑毒性大，消耗量大，而且總收率大約40％～60％。

《中國(guó)抗生素雜志》文章(編號(hào)：1001-8689(2008)05-0276-04)報(bào)道利用大孔吸附樹(shù)脂HP結(jié)合高速逆流色譜分離環(huán)孢菌素小組分，能夠?qū)Νh(huán)孢菌素實(shí)現(xiàn)富集再分離，但該方法處理規(guī)模小、設(shè)備要求高，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種大規(guī)模、高效工業(yè)化提純高純度環(huán)孢菌素A的新方法。