[發(fā)明專利]一種實時檢測煙氣暴露條件下動物腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611241605.5
• 申請日: 2016-12-29
• 公開（公告）號: CN106645492B
• 公開（公告）日: 2019-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 毛健;劉俊輝;張文娟;張其東;李鵬;柴國璧;張建勛;孫世豪;宗永立;張啟東;曾世通;席輝
• 申請（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司鄭州煙草研究院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 鄭州中民專利代理有限公司 41110
• 代理人: 姜振東

1.一種實時檢測煙氣暴露條件下動物腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化的方法，其特征在于：采用動物口鼻式吸入煙氣暴露系統(tǒng)將動物實時暴露于煙氣中，通過在線微透析技術(shù)收集動物腦組織樣品，再利用高效液相色譜-庫侖陣列電化學(xué)檢測器對腦透析液樣品中的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物進(jìn)行快速分析，從而實時監(jiān)測煙氣暴露前后動物腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的變化特征，具體步驟如下：

a. 煙氣暴露：利用吸煙機抽吸卷煙或采用氣溶膠發(fā)生器使電子煙液產(chǎn)生氣溶膠，將頭部裝有微透析探針導(dǎo)管的動物放入一個專用的實驗動物固定夾持器，以使該夾持器挾持動物僅以口鼻吸入方式暴露于一定濃度的煙氣中；

b. 腦微透析樣品收集：運行微透析系統(tǒng)后將微透析探針插入動物頭部的導(dǎo)管中連續(xù)收集動物腦透析液于在線進(jìn)樣器的定量環(huán)中，每隔一定時間通過在線進(jìn)樣器自動注入運行的高效液相色譜中；色譜條件具體如下：

色譜柱：Discovery HS F5柱，規(guī)格4.6 mm ×150 mm，3 μm；柱溫：30 ℃；流動相：A：甲醇，B：緩沖鹽液，含有40 mmol/L檸檬酸、20 mmol/L磷酸氫二鈉和0.3 mmol/L EDTA；流速：0.25 mL/min；根據(jù)各目標(biāo)物的伏安曲線設(shè)置庫侖陣列電化學(xué)檢測器的多通道工作電勢為：?50、0、50、175、200、350、400、500 mV；梯度洗脫條件如下表：

時間（min）	流動相A（%）	流動相B（%）
0	10	90
4	25	75
13	25	75
14	10	90

c. 高效液相色譜-庫侖陣列電化學(xué)檢測器分析：設(shè)定梯度洗脫程序和進(jìn)樣序列并運行高效液相色譜-庫侖陣列電化學(xué)檢測器檢測微透析樣品，使得每個樣品的檢測時間略小于該樣品的收集時間；

d. 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：配制含有多巴胺(DA)、3,4?二羥基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、5-羥色胺(5-HT)和5?羥吲哚乙酸(5-HIAA) 5種標(biāo)準(zhǔn)品的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，將系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液按由低到高的濃度順序進(jìn)行高效液相色譜-庫侖陣列電化學(xué)檢測器分析，以各目標(biāo)分析物的色譜峰面積（Y）對其相應(yīng)的濃度（X）進(jìn)行線性回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程；

e. 數(shù)據(jù)分析及處理：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算透析液樣品中各目標(biāo)物的含量，依據(jù)結(jié)果分別繪制煙氣暴露前、后各時間點腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)及其代謝物的濃度-時間變化曲線，揭示煙氣暴露引起腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)變化的規(guī)律。