[發明專利]一種葡萄糖脫氫酶突變體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201611239150.3
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN106754777B
• 公開（公告）日: 2019-06-11
• 發明（設計）人: 石利平;陳峻青;蔡進;漆志文;張維冰;葉銀梅;徐春濤;何義;陳曉佩;劉思琪
• 申請（專利權）人: 江蘇阿爾法藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 南京思拓知識產權代理事務所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

本發明公開了一種葡萄糖脫氫酶突變體及其制備方法和應用。葡萄糖脫氫酶突變體基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。一種葡萄糖脫氫酶突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。將該基因導入大腸桿菌獲得含有該基因的基因工程菌。并且通過培養該基因工程菌和優化發酵工藝，實現重組葡萄糖脫氫酶的制備。本發明提供一種催化活性、pH及熱穩定性、有機溶劑耐受性較好的葡萄糖脫氫酶突變體，可用于氧化還原反應中輔酶NADH以及NADPH的再生。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種葡萄糖脫氫酶突變體及其制備方法和應用。

背景技術

氧化還原酶被廣泛應用于催化制備手性醇、羥基酸等藥物中間體，絕大多數氧化還原反應都需要輔酶NAD(P)H的參與。因輔酶價格昂貴，穩定性差、難以重復利用，嚴重限制了氧化還原酶的工業化應用，構建高效、經濟的輔酶再生體系對于解除輔酶含量對反應的限制、降低生產成本極為重要。

輔酶再生的方法可分為全細胞法、光化學法、化學法、電化學法和酶法等。酶法再生還原態輔酶由于對輔酶的選擇性及再生效率高，且再生系統與合成系統兼容性好，因而最受青睞。

葡萄糖脫氫酶(glucose dehydrogenase,GDH，EC 1.1.1.47)屬于短鏈醇脫氫酶家族，由4個相同的亞基組成，廣泛存在于原核與真核生物中。葡萄糖脫氫酶根據其所結合的輔酶可分為三種類型：吡咯喹啉醌依賴型、FAD依賴型及NAD(P)⁺依賴型。其中NAD(P)⁺依賴型葡萄糖脫氫酶可特異性催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸內酯，同時將NAD(P)⁺轉化為NAD(P)H，從而解決NADH以及更為昂貴的NADPH的再生問題。由于其對輔酶NAD(P)⁺的比活高，對還原性輔酶NAD(P)H的再生能力強，且既可用于NADH的再生，又可用于NADPH的再生，NAD(P)⁺依賴型葡萄糖脫氫酶得到了廣泛的應用。該酶可從多種微生物如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)及巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)等中獲得。

發明內容

本發明的目的是針對現有技術的上述不足，提供一種葡萄糖脫氫酶突變體。

本發明的另一目的是提供該葡萄糖脫氫酶突變體的制備方法。

本發明的又一目的是提供該葡萄糖脫氫酶突變體的應用。

本發明的目的可通過以下技術方案實現：

葡萄糖脫氫酶突變體基因，其野生型基因其來源為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis T1(GenBank:KU682779.1)，根據易錯PCR方法對其進行突變，從而獲得該氨基轉移酶突變體目的基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO.1。

一種葡萄糖脫氫酶突變體，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

含有所述的葡萄糖脫氫酶突變體基因的重組載體。其可通過本領域常規方法將本發明的葡萄糖脫氫酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構建而成，如質粒pUC18，pUC19，pET系列等，更優選地選自pET系列。本發明的一個實施例中所使用的質粒為pET-28a。

一種生產所述的葡萄糖脫氫酶突變體的基因工程菌，所述基因工程菌中包含本發明所述的葡萄糖脫氫酶突變體基因或本發明所述的重組載體。

所述基因工程菌的宿主細胞優選為大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。

所述基因工程菌優選保藏號為CCTCC M 2016059的E.Coli G06，于2016年1月22日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學。