[發(fā)明專利]一種羰基還原酶突變體及其在手性醇制備中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201611239139.7
• 申請(qǐng)日: 2016-12-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN106947772B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石利平;陳峻青;蔡進(jìn);漆志文;張維冰;葉銀梅;徐春濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇阿爾法藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/53
• 分類號(hào): C12N15/53;C12N9/04;C12N15/70;C12N1/21;C12P7/62
• 代理公司: 南京思拓知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32288
• 代理人: 呂鵬濤

本發(fā)明公開(kāi)了一種羰基還原酶突變體及其在手性醇制備中的應(yīng)用。一種羰基還原酶突變體基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。一種羰基還原酶突變體，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。一種用于生產(chǎn)羰基還原酶的基因工程菌，并且通過(guò)培養(yǎng)該基因工程菌和優(yōu)化發(fā)酵工藝，實(shí)現(xiàn)重組羰基還原酶的制備，并將其用于不對(duì)稱催化合成(R)?2?羥基?4?苯基丁酸乙酯。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種羰基還原酶及其在手性醇制備中的應(yīng)用,具體涉及一種羰基還原酶及其基因，及含有該羰基還原酶基因的重組表達(dá)載體和基因工程菌，以及其重組酶和該重組酶的制備方法，及利用該重組酶不對(duì)稱催化制備光學(xué)活性手性醇，特別是催化合成普利類藥物重要手性中間體(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法。

背景技術(shù)

普利類藥物是重要的抗高血壓藥物，其含有的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)可作用于腎素-血管緊張素系統(tǒng)RAS，并顯著抑制其中的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶的產(chǎn)生，從而減少血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的生成并使血壓下降，達(dá)到控制血壓、保護(hù)靶器官的作用，可用于治療高血壓和充血性心力衰竭等心血管疾病。

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯((Ethyl(R)-2-hydroxy-4-phenyl-butyrate,(R)-HPBE)，CAS號(hào)90315-82-5)是合成多種血管緊張肽轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEⅠ)和充血性心力衰竭藥物的重要手性中間體，其研究具有較大的實(shí)用意義和工業(yè)應(yīng)用前景。(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯是一種手性仲醇，為無(wú)色透明油狀液體，不溶于水，易溶于氯仿，乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，沸點(diǎn)212℃，相對(duì)密度1.075，分子式C₁₂H₁₆O₃，分子量208.25。

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的合成方法包括化學(xué)法和生物法，生物法又分為生物拆分法和生物還原法，其中生物法合成(R)-HPBE具有對(duì)環(huán)境污染小，反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，具有很好的工業(yè)應(yīng)用效果。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種制備羰基還原酶的方法，并發(fā)明了應(yīng)用該酶催化合成(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯等光學(xué)活性手性醇的方法。

本發(fā)明提供一種具有較高催化活性、對(duì)映選擇性和較好底物耐受性的羰基還原酶，及含有該羰基還原酶基因的重組表達(dá)載體和基因工程菌，以及其重組酶和該重組酶的制備方法，及利用該重組酶不對(duì)稱催化制備光學(xué)活性手性醇，特別是催化合成普利類藥物重要手性中間體(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的方法。

本發(fā)明提供一種羰基還原酶突變體，其是(1)由序列表中SEQ ID NO.2所示氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(2)或是由SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或者添加一個(gè)或者幾個(gè)氨基酸且具有羰基還原酶活性的由(1)衍生的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的羰基還原酶突變體基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其野生型基因序列來(lái)自光滑假絲酵母Candida glabrata CBS 138，經(jīng)過(guò)易錯(cuò)PCR方法對(duì)其進(jìn)行突變得到。本發(fā)明羰基還原酶突變體基因可以通過(guò)PCR擴(kuò)增法、重組法或者化學(xué)合成方法獲得。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含本發(fā)明的羰基還原酶突變體基因的核苷酸序列的重組表達(dá)載體。其可通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)方法將本發(fā)明的羰基還原酶基因的核苷酸序列連接于各種載體上構(gòu)建而成，如質(zhì)粒pUC18，pUC19，pBV322，pBAD，pET系列等，更優(yōu)選地選自pET系列。本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中所使用的質(zhì)粒為pET-28a。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種包含本發(fā)明的羰基還原酶基因或其重組表達(dá)載體的基因工程菌，本發(fā)明優(yōu)選大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)。將前述重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸埃希氏菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中，即可得到本發(fā)明優(yōu)選的基因工程菌。