[發明專利]系列天藍色鏈霉菌高效異源表達宿主的構建與應用

在審

• 申請號: 201611234403.8
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN108251344A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 蘆銀華;李雷;鄭國松;楊晟;姜衛紅
• 申請（專利權）人: 中國科學院上海生命科學研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12P13/02;C12P17/16;C12P19/62;C12P21/02;C12R1/465
• 代理公司: 上海專利商標事務所有限公司 31100
• 代理人: 韋東

本發明涉及系列天藍色鏈霉菌高效異源表達宿主的構建與應用。具體而言，本發明提供一種經基因工程改造的天藍色鏈霉菌，所述天藍色鏈霉菌的基因組中含有2個以上attB位點。本發明還提供提高天藍色鏈霉菌中插入多拷貝基因簇的效率的方法、制備天然產物或提高天然產物的產量的方法以及相應的用途。本發明通過在天藍色鏈霉菌中引入數個attB位點，構建了一系列可一次實現目標基因簇多拷貝擴增的天藍色鏈霉菌，通過增加基因簇拷貝數目，從而提高了目標產物的產量。

技術領域

本發明屬于合成生物學技術領域，具體地，本發明涉及系列天藍色鏈霉菌高效異源表達宿主的構建與應用。

背景技術

微生物來源的天然產物具有廣泛的生物學活性，在醫學、動物保健和植物保護等領域發揮著十分重要的作用。伴隨大規模的微生物基因組和宏基因組測序，大量的次級代謝產物生物合成基因簇(Biosynthetic gene clutsers，BGC)被揭示。令人驚訝的是，90％左右的基因簇在常規的實驗條件下均未表達(被稱之為隱性或沉默的基因簇，Cryptic orsilent BGCs)。這些等待挖掘的“寶貴財富”標志著我們正進入抗生素研發的第二個黃金時代。如何快速、高效獲取并表達這些未知的基因簇，是目前亟需解決的關鍵問題之一。由于百分之九十九的微生物不可培養，而可培養的微生物中大部分也難以進行有效的遺傳操作，因此開發高效異源表達宿主是十分重要而迫切的。

最近，對100種重要的微生物次級代謝產物的調查顯示，其中83％是由放線菌(actinomycetes)產生的。因此，通用、高效的放線菌底盤菌的開發在新的天然產物鑒定與開發中不可或缺。天藍色鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)，作為放線菌研究的模式菌，具有生長快、遺傳操作簡單等優點。2011年，John Innes Center的Meryn Bibb實驗室在出發菌M145的基礎上開發了新一代異源表達宿主M1146和M1152。他們首先刪除了M145中四個活性的生物合成基因簇，包括放線紫紅素(actinorhodin,ACT)、十二烷基靈菌紅素(undecylprodigiosin，RED)、鈣依賴型抗生素(calcium-dependent antibiotic，CDA)和黃色I型聚酮類化合物(yellow type I cryptic polyketide,yCPK)，構建出了基因組簡化、代謝物譜簡單的底盤菌M1146。其后，他們繼續在M1146中引入了RNA聚合酶β亞基的一個特定的點突變[RpoB(S433L)]，提高次級代謝產物的合成能力)，構建出了第二個底盤菌M1152。過去幾年里，多種不同結構類型的天然產物合成基因簇在M1146和M1152中均實現了成功表達。不過，這些天然產物異源表達的產量還是很低，有時不能滿足新化合物的鑒定和/或組合生物合成的研究。

因此，十分必要開發在M1146或M1152的基礎上開發更為高效的表達宿主。

發明內容

本發明的目的是提供一系列天藍色鏈霉菌高效異源表達宿主，用于新的活性天然產物挖掘、組合生物合成研究和重要藥物的產量優化。

本發明第一方面提供經基因工程改造的天藍色鏈霉菌，所述天藍色鏈霉菌的基因組中含有2個以上attB位點，例如含有2～5個或2～4個attB位點。

在一個或多個實施方案中，相鄰兩個attB位點之間間隔500kb以上。

在一個或多個實施方案中，所述attB位點存在于所述天藍色鏈霉菌的被刪除的基因簇的位置上。

在一個或多個實施方案中，所述天藍色鏈霉菌的基因組中被刪除的基因簇選自：放線紫紅素(ACT)、十二烷基靈菌紅素(RED)、鈣依賴型抗生素(CDA)和黃色I型聚酮類化合物(yCPK)的生物合成基因簇。

在一個或多個實施方案中，所述天藍色鏈霉菌的RNA聚合酶β亞基中存在S433L突變。