[發明專利]VRE/MRSA/KPC/NDM?1檢測基因芯片的制備和用途

在審

• 申請號: 201611230917.6
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN107130016A
• 公開（公告）日: 2017-09-05
• 發明（設計）人: 王升啟;吳冰;劉琪琦;陳蘇紅;宋燚
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院放射與輻射醫學研究所;天津威高分子診斷科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及VRE/MRSA/KPC/NDM-1檢測基因芯片的制備和用途，屬于基因芯片檢測技術領域。

背景技術

感染性疾病一直以來都對人類健康和生命構成很大威脅，20世紀40年代抗生素的發現使得一些感染性疾病在治療上取得了重大進展，但隨著抗生素的不合理使用和濫用，使得細菌耐藥率不斷上升。細菌耐藥性已發展成為全球主要的公共健康威脅，由耐藥菌引起的感染使治療無效，增加患者的痛苦、喪失勞動力甚至是死亡。在抗生素選擇壓力下一些致病菌對抗菌藥物出現耐藥性，從而使抗菌藥物療效降低甚至失效。耐藥趨勢也由單一耐藥發展為多重耐藥（multiple resistance, MDR），尤其是近些年來被媒體稱為的“超級細菌”的出現，如抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA），耐萬古霉素腸球菌（vancomycin-resistant enterococci,VRE），“新德里”金屬-β-內酰胺酶（New Delhi metallo-β-lactamase,NDM-1）等，幾乎對抗生素產生了泛性耐藥，對臨床治療產生極大的影響，危害人類健康，克服抗藥性極其緊迫。面對如此嚴重的細菌耐藥形勢，加強細菌耐藥監測變得十分重要。如果在用藥前可以檢測出某種耐藥基因，將大大有利于指導臨床用藥，延緩耐藥的發展，因此快速、準確的早期診斷是預防及控制耐藥株暴發流行、延緩耐藥性發展的關鍵。

耐藥基因的檢測方法主要包括表型檢測和基因型檢測兩大類，其中傳統的表型檢測以藥敏檢測方法為主，主要包括紙片擴散法、稀釋法、Etest（表型確認）、改良Hodge實驗、自動化藥敏檢測（VITEK 2系統、BD Phoenix、ATB系統 ）等。但傳統的表型檢測方法實驗周期長，操作繁瑣，且經驗依賴性較強，不能滿足臨床治療的需要。而基因芯片恰好具有高通量，高靈敏度，操作簡單，成本低，實驗周期短等優點，適用于耐藥基因的高通量檢測和臨床治療研究。

發明內容

本發明的目的在于針對耐藥基因檢測領域存在的一些不足，研制一種高通量、特異、敏感、快速的耐藥基因檢測DNA芯片，能同時檢測5種常見的耐藥基因和3種相關的病原菌，包括抗萬古霉素腸球菌（VRE）的耐藥基因VanA、VanB；可編碼新德里金屬-β-內酰胺酶NDM-1耐藥基因；抗甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的耐藥基因mecA；編碼碳青霉烯酶KPC基因；以及糞腸球菌特異基因Fddl、屎腸球菌特異基因Sddl、金黃色葡萄球菌特異基因nuc。為抗生素耐藥菌的臨床診斷、表型確證及分子流行病學調查提供一種新的檢測手段。

為了達到上述目的，本發明VRE/MRSA/KPC/NDM-1檢測基因芯片，其制備方法如下。

步驟一：制備耐藥基因特異性引物。

選擇耐藥基因VanA、VanB、NDM-1、mecA、KPC；特異基因Fddl、Sddl和nuc作為檢測靶基因，優選八對引物序列及其對應的擴增靶標，如表1所示。

表1 引物序列及對應的擴增靶標。

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步驟二：制備特異性寡核苷酸探針。

根據每種耐藥基因的序列比對，在上下游引物范圍內的序列相對特異區進行探針的設計。篩選出耐藥基因各特異性探針序列及其對應的擴增靶標，如表2所示。

表2 寡核苷酸探針序列及對應的靶標。

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步驟三：制備寡核苷酸芯片。

一個優選的實施方案，步驟二中的各個寡核苷酸探針在點樣時，用2×點樣液（6×SSC，0.1%SDS）稀釋至終濃度50μM。用市售的基因芯片點樣儀將探針點到空白的醛基化修飾玻片上，探針的點樣量均為3nL。寡核苷酸芯片制備完畢后，使用前至少在室溫放置干燥48小時。該芯片特征在于寡核苷酸探針陣列中同時包括5種超級耐藥基因和3種病原菌特異基因，共8條特異性探針，其探針陣列如表3所示。其中片基質控探針為20T序列，5’端bio標記、3’端NH2修飾，用來監測醛基片片基質量；A管內標探針為細菌16s1基因，B管內標探針細菌16s2 基因，用來監測A、B管多重體系質量；陰性探針用來檢測有無污染；所有探針的點樣量均為3nL，使用前至少在室溫放置干燥48小時。

表3 寡核苷酸探針陣列。

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步驟四：建立多重不對稱PCR體系。