[發明專利]重組人VEGF多肽腫瘤疫苗

在審

• 申請號: 201611230564.X
• 申請日: 2016-12-28
• 公開（公告）號: CN106806890A
• 公開（公告）日: 2017-06-09
• 發明（設計）人: 馬雁冰;白紅妹;黃惟巍;夏燁;劉存寶;孫文佳;楊旭
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫學生物學研究所
• 主分類號: A61K39/00
• 分類號: A61K39/00;A61K39/39;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及醫學生物技術及免疫學領域，具體地，涉及人VEGF多肽疫苗的構建方法。

技術背景

研究表明，血管生成在腫瘤的發生發展中具有重要作用，抑制腫瘤血管生成已成為一種新的治療方法。許多活性因子已被確認參與這個復雜的過程，其中包括：aFGF、bFGF、TGF-α、VEGF等。然而，過去數年所做的研究已確立在腫瘤血管生成中，血管內皮生長因子(VEGF)是目前已知的一個最有效的和最特異的促血管生成因子。在大多數腫瘤中，VEGF mRNA是過度表達的，因而被認為是抑制腫瘤血管生成最有效的靶標。

多種策略已被用來抑制VEGF的作用，其中包括靶向VEGF受體(VEGFR)、使用基因療法提供反義寡核苷酸、使用可溶性VEGFR、受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑的開發,以及針對VEGF的單克隆抗體。目前最有前景的方法是重組的人源化的小鼠抗人VEGF單克隆抗體。此抗體已經在轉移性癌癥患者進行過測試。然而,運用抗體進行治療有很多缺點，重要的是，被動免疫策略牽涉把抗體注入病人體內,它的免疫力是短暫的，因為抗體在機體循環中會很快被清除。其次，單克隆抗體本身也是免疫原，導致其不能長期使用。再者，為了維持有效的免疫必須持續大量給患者輸入抗體，患者須承受嚴重的經濟負擔。使用疫苗來預防或治療腫瘤是一種極具吸引力的方式，因為疫苗療法的預期副作用最小。抗腫瘤疫苗包括完整的細胞疫苗、蛋白質和DNA疫苗,以及肽疫苗；每種類型的抗腫瘤疫苗都有其優點和局限性。用肽制備的抗腫瘤疫苗目前引起研究者很大的興趣，因為這種形式的疫苗較為安全（沒有病原體和致癌物質的潛在威脅）、穩定及容易制備，能夠大大降低經濟成本。重要的是，相對于被動免疫而言，肽疫苗能夠致使機體產生持續的免疫反應和記憶。但是肽疫苗的缺陷在于未經修飾的肽極少具有免疫原性。我們通過將VEGF抗原肽呈遞在高度有序、高度重復的Qβ病毒樣顆粒上賦予了其極高的免疫原性，有望作為一種有效的方法來預防或治療腫瘤的發生發展。

發明內容

本發明的目的在于，將人VEGF抗原肽呈遞在高度有序、高度重復的Qβ病毒樣顆粒上賦予其極高的免疫原性，為腫瘤免疫治療提供一種新的治療藥物。

為了實現上述目的，本發明的技術方案是：一種重組人VEGF多肽腫瘤疫苗，其特征在于，利用共表達系統在大腸桿菌BL21（DE3）中同時表達噬菌體Qβ外殼蛋白以及C末端插有人VEGF抗原表位的Qβ外殼蛋白，經純化后獲得在外表呈遞有人VEGF抗原表位的Qβ病毒樣顆粒。

該融合蛋白疫苗的特點是，用該疫苗免疫小鼠后，小鼠體內可產生高滴度的抗人VEGF抗體，并且該抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF₁₆₅的生物學活性。并且利用這種呈遞方式獲得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可對C57BLACK6小鼠體內的TC-1腫瘤細胞起到一定的抑制作用。

附圖說明

圖1顯示了通過共表達純化后得到的病毒樣顆粒；

圖2顯示重組人VEGF多肽疫苗加鋁佐劑免疫小鼠后產生了較好的抗體應答；

圖3顯示重組人VEGF多肽疫苗加鋁佐劑免疫小鼠后產生的特異性抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF₁₆₅的生物學活性。

圖4顯示利用共表達將抗原肽呈遞在Qβ病毒樣顆粒表面的方式獲得的同源鼠VEGF多肽疫苗免疫小鼠可對C57BLACK6小鼠體內的TC-1腫瘤細胞起到一定的抑制作用。

具體實施方式

依照本發明的技術方案，采用人工合成的方法獲得人VEGF抗原肽的核酸序列，將其插入噬菌體Qβ外殼蛋白基因的C末端，利用共表達的方式在大腸桿菌BL21（DE3）中同時高效表達噬菌體Qβ外殼蛋白以及C末端插有人VEGF抗原肽的Qβ外殼蛋白，表達產物經超聲破碎、硫酸銨沉淀、蔗糖密度梯度離心的純化得到外表呈遞有人VEGF抗原肽的Qβ病毒樣顆粒疫苗。該疫苗與鋁佐劑混合后免疫小鼠獲得的特異性抗體在HUVEC細胞增殖試驗中能中和人VEGF₁₆₅的生物學活性。同時，通過此方法利用與人VEGF抗原肽同源的小鼠VEGF抗原肽構建的疫苗免疫小鼠后能抑制C57BLACK6小鼠體內TC-1腫瘤細胞的生長。

實施例

實施例1：重組人VEGF多肽疫苗原核表達質粒的構建