[發(fā)明專利]制備蛋白酶的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611230292.3
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106636043B
• 公開（公告）日: 2020-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王俊;張利萍;馮甲
• 申請（專利權(quán)）人: 廣州立白企業(yè)集團有限公司
• 主分類號: C12N9/56
• 分類號: C12N9/56;C12N9/60
• 代理公司: 廣州華進聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 萬志香

1.一種制備蛋白酶的方法，其特征在于，包括如下步驟：

在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)微生物，所述微生物為芽孢桿菌或酵母，并在所述微生物生長的特定時間段內(nèi)持續(xù)向所述培養(yǎng)基中加入蛋白酶抑制劑，所述蛋白酶抑制劑為硼酸衍生物，所述特定時間段處于所述微生物生長的對數(shù)期的末期至穩(wěn)定期的前期的時間段內(nèi)，所述特定時間段持續(xù)時間為5h～20h，所述蛋白酶抑制劑在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.2g/L～0.6g/L；以及

所述微生物分泌產(chǎn)生蛋白酶。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，向所述培養(yǎng)基中加入所述蛋白酶抑制劑的速率為0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述微生物為枯草芽孢桿菌或畢赤酵母。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制劑選自4-甲酰基苯基硼酸、N-2-吡嗪羰基-L-苯丙氨酸-L-亮氨酸硼酸、噻吩-3-硼酸、3-乙酰氨基苯基硼酸、N-酰基-肽基硼酸、4-甲基噻吩-2-硼酸、2-氟-5-(甲氧羰基)苯硼酸、5-乙基噻吩-2-硼酸、2-氟-4-(甲氧羰基)苯硼酸、5-溴噻吩-2-硼酸、4-(1-哌啶基甲基)苯硼酸、4-(1-吡咯烷基甲基)苯硼酸、二苯并噻吩基-1-硼酸、2-(甲氧羰基)-4-甲基苯硼酸、2,6-二氯-3-甲基苯硼酸、二苯并呋喃-4-硼酸、2-異丙氧基苯硼酸、2-氟-4-甲砜基苯硼酸、呋喃-2-硼酸、3-氟-4-甲砜基苯硼酸、1-Boc-7-甲氧基吲哚-2-硼酸、呋喃-3-硼酸、4-(1-哌啶基磺酰基)苯硼酸、3-乙酰氨基苯硼酸、3-甲氧基噻吩-2-硼酸、2-甲基-4-甲氧基苯硼酸、5-甲基-3-吡啶硼酸、5-正丙基噻-2-硼酸、10-苯基-9-蒽硼酸、3-溴噻吩硼酸、5-甲基-6-氟-3-吡啶硼酸、3-溴噻吩-4-硼酸、2,6-二氟-3-吡啶硼酸、4-甲酰基苯基硼酸、3-氯-4-甲氧羰基苯硼酸、苯硼酸、2-氯-4-甲氧基苯硼酸、5-乙基呋喃-2-硼酸、3-甲基-4-氯苯硼酸、二苯代硼酸、4-(環(huán)丙基氨磺酰基)苯硼酸和5-甲基氧呋喃-2-硼酸中的至少一種。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，還包括在所述微生物生長的特定時間段內(nèi)持續(xù)向所述培養(yǎng)基中加入蛋白酶穩(wěn)定劑，所述蛋白酶穩(wěn)定劑選自鎂離子和鈣離子中的至少一種。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述蛋白酶穩(wěn)定劑選自CaCl₂和MgCl₂中的至少一種。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述特定時間段持續(xù)時間為20h，所述鎂離子和所述鈣離子中的至少一種在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.0125mol/L～0.025mol/L。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述微生物為枯草芽胞桿菌，在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)所述枯草芽胞桿菌35h～40h后開始向所述培養(yǎng)基中加入4-甲酰基苯基硼酸，所述4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的時間段內(nèi)持續(xù)的加入至所述培養(yǎng)基中，所述4-甲酰基苯基硼酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.2g/L～0.6g/L，向所述培養(yǎng)基中加入所述4-甲酰基苯基硼酸的速率為0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，還包括在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)所述枯草芽胞桿菌35h～40h后開始向所述培養(yǎng)基中加入蛋白酶穩(wěn)定劑，所述蛋白酶穩(wěn)定劑選自鎂離子和鈣離子中的至少一種，所述鎂離子和所述鈣離子中的至少一種在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.0125mol/L～0.025mol/L。

10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備蛋白酶的方法，其特征在于，所述微生物為畢赤酵母，在培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)所述畢赤酵母30h～40h后開始向所述培養(yǎng)基中加入4-甲酰基苯基硼酸，所述4-甲酰基苯基硼酸在5h～20h的時間段內(nèi)持續(xù)的加入至所述培養(yǎng)基中，所述4-甲酰基苯基硼酸在所述培養(yǎng)基中的終濃度為0.2g/L～0.6g/L，向所述培養(yǎng)基中加入所述4-甲酰基苯基硼酸的速率為0.01g/(L·h)～0.12g/(L·h)。