[發(fā)明專利]一種夫替瑞林的合成方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201611227425.1 | 申請日： | 2016-12-27 |
| 公開（公告）號： | CN106749542B | 公開（公告）日： | 2020-09-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 沈永剛;付坤;謝振亮;程益明;沈永良 | 申請（專利權(quán)）人： | 杭州固拓生物科技有限公司 |
| 主分類號： | C07K7/23 | 分類號： | C07K7/23;C07K1/06;C07K1/04 |
| 代理公司： | 杭州裕陽聯(lián)合專利代理有限公司 33289 | 代理人： | 姚宇吉 |
| 地址： | 310000 浙江省杭州市經(jīng)濟開發(fā)區(qū)*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 夫替瑞林 合成 方法 | ||
1.一種夫替瑞林的合成方法，其特征在于，所述合成方法具體包括以下步驟：
步驟a，制備樹脂：Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，以二氯甲烷為溶劑，加入Fmoc-Pro-OH溶解和2-Chlorotrityl Chloride Resin，加入有機堿N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)反應(yīng)，然后分別采用DMF*2+DCM*2+甲醇*2進行洗滌，得到Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，其中2-Chlorotrityl Chloride Resin的替代度0.3-1.1mmol/g；
步驟b，制備肽樹脂：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-2CTC Resin；以Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin為起始，將樹脂F(xiàn)moc-Pro-2-Chlorotrityl Resin浸泡在有機溶劑DCM中，輔以攪拌使其充分溶脹。抽干，用DMF洗滌三遍，抽掉；加入脫帽試劑：20％DBLK+DMF，分別反應(yīng)兩次；然后洗滌6遍，具體洗滌順序：DMF+甲醇+DMF+(DCM+DMF)+DMF+DMF，抽干；以DMF為溶劑，加入DIPEA和TBTU+HOBT，或DIC和HOBT，采用固相合成法逐一偶聯(lián)具有保護基團的氨基酸，最后合成肽樹脂；
步驟c，制備全保護肽鏈片段：Pyr-His(trt)-Trp(boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-Gly-Leu-Arg(pbf)-Pro-OH，配置三氟乙酸(TFA)DCM混合溶液，將步驟b得到的肽樹脂加入切肽試劑，加少量有機堿：N,N-二異丙基乙胺調(diào)解pH至中性，得到全保護肽鏈片段；
步驟d，制備全保護夫替瑞林：加入PYBOP和乙胺鹽酸鹽，加入有機堿:N,N-二異丙基乙胺調(diào)節(jié)pH反應(yīng)，對全保護肽鏈片段的C端進行乙胺化得到全保護夫替瑞林；
步驟e，切除側(cè)鏈得到夫替瑞林：在全保護夫替瑞林中加入冰切割試劑低溫保持10-20min后，加熱至25℃反應(yīng)2-3h，得到夫替瑞林粗品，其中切割試劑為三氟乙酸：三異丙基硅烷：巰基丙酸：苯酚：H2O＝90:4:3:2:1；
步驟f，粗肽純化。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夫替瑞林的合成方法，其特征在于，所述步驟a中，室溫反應(yīng)2-4小時，抽干后進行多次洗滌，然后加入無水甲醇封閉樹脂上未連接Fmoc-Pro-OH的活性基團。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的夫替瑞林的合成方法，其特征在于，所述步驟a中，多次洗滌，分別采用DMF洗兩次，然后用DCM洗兩次，最后用無水甲醇洗兩次，接著加入無水甲醇攪拌或震蕩反應(yīng)1-3小時封閉樹脂上未連接Fmoc-Pro-OH的活性基團；抽干，得到Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Resin。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夫替瑞林的合成方法，其特征在于，所述步驟a中2-Chlorotrityl Chloride Resin的替代度為0.4-0.7mmol/g。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夫替瑞林的合成方法，其特征在于，所述步驟b中肽樹脂的制備方法為：
(1)取樹脂F(xiàn)moc-Pro-2-Chlorotrityl Resin，浸泡在二氯甲烷中20-40min，抽干，用DMF洗滌三遍，抽干；
(2)加入脫帽試劑，反應(yīng)兩次，去除Fmoc保護基團；洗滌至少6次，洗滌順序：DMF，無水甲醇，DMF，DCM+DMF，DMF，DMF，抽干；以DMF為溶劑，加入Fmoc-Arg(pbf)-OH，及1-羥基苯并三唑和N,N-二異丙基碳二亞胺組合或N,N-二異丙基乙胺和縮合劑組合，其中縮合劑為O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸和1-羥基苯并三唑混合物；偶聯(lián)1-3小時，茚三酮檢測反應(yīng)進程，偶聯(lián)結(jié)束后抽掉反應(yīng)液，用DMF洗滌3遍；重復(fù)(2)上述步驟直至完成最后一個氨基酸焦谷氨酸PGlu；DMF洗三遍，DCM洗三遍，無水甲醇洗三遍,無水甲醇每次5-10min，洗滌后干燥得到肽樹脂。
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