[發明專利]一種桿菌類生物標志物靈敏檢測的方法

在審

• 申請號: 201611223254.5
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN106841158A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 成漢文;錢煒;朱麗瑩;陳浩天;羅謹
• 申請（專利權）人: 上海應用技術大學
• 主分類號: G01N21/65
• 分類號: G01N21/65;B82Y40/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司31253
• 代理人: 楊軍

技術領域

本發明涉及標志物檢測技術領域，具體地說，涉及一種桿菌類生物標志物靈敏檢測的方法。

背景技術

菌種中主要是桿菌菌屬能形成芽孢。從食品的安全角度來講，某些芽孢桿菌可能會引發食物中毒(如蠟樣芽胞桿菌)；雖然已有很多研究工作者通過免疫分析法、染色法、PCR或PCR-ELISA法、流式細胞術、毛細管電色譜等直接或間接的方法來檢測芽孢桿菌。然而這些方法存在一些問題，如：使用的試劑或儀器昂貴，需對操作人員培訓，操作繁瑣且分析時間較長或檢測結果定量較難等。

相對來說，用光譜法來檢測化學或生物通常比較快，并且只有振動光譜可提供被測物的指紋信息(結構與官能團)。已經有一些光譜法被成功用于桿菌類芽孢的檢測，如：光致發光、紅外光譜和拉曼或表面增強拉曼光譜(SERS)等。早期已有報道是利用具有很強SERS效應的銀納米粒子作為基底，并證明了SERS手段能夠實現生物標志物的快速、靈敏檢測。然而，用作生物體系中的SERS基底時，銀粒子表面容易被氧化導致穩定性下降，銀也具有抗微生物性，因此能在其表面上實現生物兼容的種類有限，這些問題讓銀溶膠在某些方面的應用受到了局限。相對來說，金溶膠或金粒子表面較穩定不易氧化，而且具有更廣的生物兼容性，而這方面的研究較少。

發明內容

針對以上問題，本發明的目的是提供一種穩定的、SERS效應強的桿菌類生物標志物靈敏檢測的方法。

本發明中，由非離子型高分子化合物作為粘附劑，在圓形金電極表面上組裝上一定尺寸范圍的金納米粒子，而金粒子表面組裝上桿菌類芽孢中特有的成分，即其生物標志物，此種成分在其他菌類中不多見，常見于桿菌類芽孢中。然后利用表面增強拉曼光譜(簡稱“SERS”)技術在金電極基底上對金納米粒子/芽孢標志物的復合體進行檢測，納米金粒子-粒子之間以及粒子-電極表面之間所具有的SERS“熱點”效應很強，可以對微量被測物進行靈敏檢測并獲得較理想的檢測限。

本發明的技術方案具體介紹如下。

一種桿菌類生物標志物靈敏檢測的方法，具體步驟如下：

1)將經過拋光處理的金電極在非離子型高分子化合物的乙醇溶液中浸泡，之后再用乙醇和去離子水洗滌，得到經非離子型高分子化合物修飾的金電極；

2)將經非離子型高分子化合物修飾的金電極浸泡在金納米粒子溶膠中進行納米粒子的自組裝，得到金粒子組裝的金電極復合基底；

3)將不同濃度的桿菌類生物標志物的溶液滴加到金粒子組裝的金電極復合基底上，然后將其安裝到拉曼光譜儀的樣品臺上進行檢測，實現桿菌類生物標志物的靈敏檢測；其中：所述桿菌類生物標志物為2,6-吡啶二羧酸。

本發明中，步驟1)中，金電極為圓形金面電極。

本發明中，步驟1)中，拋光處理時采用鋁粉。

本發明中，步驟1)中，拋光區域為直徑在1.5-2.5mm直徑的圓形區域。

本發明中，步驟1)中，非離子型高分子化合物的乙醇溶液的質量濃度為2～10wt％。非離子型高分子化合物為聚乙烯吡咯烷酮。

本發明中，步驟2)中，金納米粒子溶膠由HAuCl₄和檸檬酸鈉反應得到；金納米粒子溶膠中的金納米粒子的粒徑在1～100nm之間。

本發明的桿菌類生物標志物靈敏檢測的方法，具有以下優點

(1)穩定性好。本發明采用在生物體系中穩定性好的金電極和金納米粒子作為基底，克服了早期報道大部分所采用的銀納米粒子作為基底在生物體系中表面容易被氧化導致穩定性下降的問題，金表面較穩定不易氧化。

(2)兼容性強。本發明采用的金體系，避免了以前用銀作為基底帶來的抗微生物性，能在銀表面上實現生物兼容的種類有限，相對來說，金溶膠或金粒子具有更廣的生物兼容性，可以有多種方法將生物分子兼容到其表面上。

(3)表面增強SERS效應高。經過粒徑優化后制備的SERS基底實現了金粒子-粒子之間以及金粒子與金電極之間存在足夠多的表面增強拉曼光譜(SERS)檢測的“熱點”，利用金粒子之間以及金粒子和金電極之間的雙重共振耦合效應，可以獲得很強的SERS響應，為信號放大奠定基礎。利用表面增強拉曼光譜(SERS)可以獲得金納米粒子表面上被測物分子極大增強的信號，解決了水相中被測物分子的SERS信號較弱的問題。本發明的方法用于生物標志物靈敏檢測，其檢出限低至0.0001ppm。