[發明專利]一種綠盲蝽精氨酸激酶基因片段及其克隆方法

在審

• 申請號: 201611222213.4
• 申請日: 2016-12-27
• 公開（公告）號: CN107435048A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 張未仲;李捷;周旭凌;胡增麗;李慶亮;趙龍龍
• 申請（專利權）人: 山西省農業科學院果樹研究所
• 主分類號: C12N15/54
• 分類號: C12N15/54;C12N15/10
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種綠盲蝽精氨酸激酶基因片段及其克隆方法。

背景技術

綠盲蝽學名Apolygus lucor μm(Meyer-Dür.)，屬半翅目，盲蝽科。別名花葉蟲、小臭蟲等。幾遍全國各棉區。是我國黃河流域、長江流域為害棉花的多種盲蝽蟓的優勢種，綠盲蝽以前為害棉花為主，近年來從棉花次要害蟲上升為主要害蟲。為害特點成、若蟲刺吸棉株頂芽、嫩葉、花蕾及幼鈴上汁液，幼芽受害形成僅剩兩片肥厚子葉的“公”棉花。葉片受害形成具大量破孔、皺縮不平的“破葉瘋”和。腋芽、生長點受害造成腋芽叢生，破葉累累似掃帚苗。幼蕾受害變成黃褐色干枯或脫落。棉鈴受害黑點滿布，僵化落鈴。而且，開始大量為害棗和葡萄。

目前，現有技術對綠盲蝽的基因研究主要集中在化學感受態蛋白，氣味蛋白等方面。還沒有對精氨酸激酶方面研究的相關報道。

發明內容

為了克服現有技術中存在的缺陷，本發明提供一種綠盲蝽精氨酸激酶基因片段及其克隆方法，

其技術方案如下：

一種綠盲蝽精氨酸激酶基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：7所示。

一種綠盲蝽精氨酸激酶基因片段的克隆方法，包括以下步驟：

步驟1、活體蟲采集；

步驟2、RNA提取，新鮮蟲體和抑制劑浸泡蟲體分別提取總RNA，使用天根生化科技有限公司的動物組織總RNA提取試劑盒進行抽提；

步驟3、cDNA反轉錄，

取5ul總RNA作為反轉錄模板，37℃反轉錄一小時，使用天根生化科技有限公司的QuantScript RT進行反轉錄，

步驟4、引物設計

AKF1 TGCTGAAGAAGTACCTYACCA

AK-R1 TGACGGCKTCGTACTCGGTGAG

PCR反應體系：

PCR反應條件為：95℃預變性2min，重復95℃變性30sec，55℃復性1min，72℃延伸1min這變性-復性-延伸三個過程36個循環，最后在72℃保溫10min。

與現有技術相比，本發明的有益效果：

本發明研究明確了克隆片段引物及反應條件。引物設計合理，體系精簡，適合推廣應用。

附圖說明

圖1是RNA凝膠電泳檢測結果，其中，編號與上表編號對應樣品一致，M：λ-Hind III digest Marker，g：活體昆蟲。每個樣品用量50ng/孔；

圖2是測序結果，其中，膠圖編號與上表編號對應樣品一致，M：DL2000 Marker，每個樣品用量50ng/孔。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例進一步說明本發明的技術方案。

1、引物設計

按照保守域設計原則，AK、基因在NCBI中同源比對后，設計兼并引物如表一，其中AK基因有四個保守域可以設計引物。

表1 PCR基因克隆引物設計表

表1為試驗開始前設計的引物匯總表，從實驗結果來看，其中AK-F1/AK-R1為最佳的PCR組合引物。

2、RNA抽提與反轉錄

新鮮蟲體和抑制劑浸泡蟲體分別提取總RNA，使用天根生化科技有限公司的動物組織總RNA提取試劑盒進行抽提，抽提后分別用微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。檢測結果參見表2和圖1：

表2 NanoDrop 2000微量分光光度計檢測結果

RNA抽提總結：

RNA總量：cRNA反轉錄要求≥60ng，結果顯示RNA樣品總量滿足反轉錄要求；

RNA純度：要求OD260/280≥1.8，結果顯示RNA樣品純度滿足要求；

RNA完整性：經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示18s存在主帶降解；

RNA樣品總量、純度及完整性顯示，樣本(g為活體昆蟲，)的總RNA提取量大，純度好，但是18S存在降解，可嘗試進行保守域的擴增。