[發明專利]一種應用于高通量測序同時檢測T細胞和B細胞免疫組庫的引物組合及試劑盒

有效

• 申請號: 201611217595.1
• 申請日: 2016-12-26
• 公開（公告）號: CN107058484B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 孫濤;劉瀟
• 申請（專利權）人: 孫濤
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/11;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 成都九鼎天元知識產權代理有限公司 51214
• 代理人: 易小藝

本發明屬于分子生物學檢測領域，特別是涉及一種應用于高通量測序同時檢測T細胞(TCR)和B細胞(BCR)免疫組庫的引物組合及試劑盒，所述引物組合包括XCR 3’Oligo(dT)引物，XCR 5’Oligo接頭，XCR 5’端接頭引物，TCR?alpha鏈C區引物，TCR?beta鏈C區引物，BCR?Heavy鏈C區引物中的IgA、IgG和IgM，BCR?Light鏈C區引物中的Kappa和Lambda，以及標簽上下游引物；所述試劑盒包含有如權利要求1或2所述的引物組合。獲得淋巴細胞中TCR（Alpha鏈或Beta鏈）和BCR（Heavy鏈或Light鏈）的基因序列的全長信息。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，特別是涉及一種應用于高通量測序同時檢測T細胞和B細胞免疫組庫的引物組合及試劑盒。

背景技術

T、B細胞基因座上大量的V(可變區)、D(多變區)、J(連接區)基因片段在T、B細胞受體的形成中會產生各種多樣性重組。這種V-D-J基因的重組賦予了每一種T、B細胞自己獨特的T、B細胞受體(TCR、BCR)，從而使得每一個TCR和BCR的序列能有效的成為一個T、B細胞克隆的唯一生物標志物。

由于TCR和BCR基因的最大特點是V、D、J基因片段的隨機重組，所以，針對未知基因序列，很難設計一個上游引物用于識別TCR、BCR基因的5’端序列，所以也無法利用PCR技術擴增TCR、BCR基因和測序。

而另外一種TCR測序方法，多重引物PCR的方法，只能測序TCR基因中的部分序列信息，這樣使得測序基因信息不完整。另外，多重引物PCR方法的引物是根據已知V，J基因設計的，這種測序結果只局限于野生型的已知基因。但在癌癥病人中，癌細胞的基因突變是很常見的，如果白血病癌細胞的BCR或TCR產生了突變，那么已知序列的引物就有可能無法識別突變后的基因，對檢測結果來說，就容易造成假陰性。并且，多重引物PCR的免疫組庫測序方法，僅僅對TCR或者BCR測序，就已經需要幾十對的引物，如果同時檢測TCR和BCR的話，龐大的引物數量會讓整個PCR擴增的效率和特異性變得很差。

所以，目前還沒有一個技術可以在一次實驗操作中同時檢測TCR和BCR，利用我們的方法(單對引物法)可以同時檢測多個樣本的TCR和BCR，節約實驗時間和試劑、人工成本。該技術可以應用在免疫基因組學的研究中，不僅能夠檢測淋巴惡性腫瘤治療后的微小殘留病，還能夠評判HSC移植后的免疫重建、食物過敏、免疫性疾病的檢測等等。

發明內容

為了解決以上技術問題，本發明提供一種應用于高通量測序同時檢測T細胞和B細胞免疫組庫的引物組合及試劑盒，基于高通量測序同時構建T細胞受體和B細胞受體文庫構建的cDNA接頭和單對引物，通過從接頭的上游引物到C區的下游引物，同時獲得TCR和BCR基因序列的全長信息。

本發明中引物組合能有效的擴增TCR基因的全序列，使TCR二代測序文庫構建效率高效。試劑盒為用戶提供了簡單便捷的使用方法，效率穩定。能同時完成TCR和BCR的建庫，建庫的對象和組合(不同的鏈)。

解決以上技術問題的一種應用于高通量測序同時檢測T細胞和B細胞免疫組庫的引物組合，其特征在于：所述引物組合包括XCR 3’Oligo(dT)引物，XCR 5’Oligo接頭，XCR5’端接頭引物，TCR-alpha鏈C區引物，TCR-beta鏈C區引物，BCR-Heavy鏈C區引物中的IgA、IgG和IgM，BCR-Light鏈C區引物中的Kappa和Lambda，以及標簽上下游引物；每種引物序列如下：

XCR 3’Oligo(dT)引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGA 3’；

XCR 5’Oligo接頭：5’ATGCATCGGATCTTCAGCATGAACTTrGrGrG 3’；

XCR 5’端接頭引物：