[發(fā)明專利]細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611217280.7
• 申請日: 2016-12-26
• 公開（公告）號: CN106754702B
• 公開（公告）日: 2020-10-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔡海波;張偉偉;譚文松
• 申請（專利權(quán)）人: 華東理工大學(xué)
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/02
• 代理公司: 上海翼勝專利商標事務(wù)所(普通合伙) 31218
• 代理人: 翟羽;曾人泉

1.一種細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法包括以下步驟：

(1)采用密度梯度離心法分離血液單個核細胞；(2)將步驟(1)新鮮分離的血液單個核細胞以1～20×10⁵cells/ml接種于完全RPMI1640培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并使用細胞因子組合刺激；

(3)將培養(yǎng)裝置置于37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中的搖床上進行動態(tài)懸浮培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為50～130rpm；

(4)根據(jù)細胞密度調(diào)整培養(yǎng)基及細胞因子組合補加速率，通過采用工作體積逐級增大的培養(yǎng)裝置，維持培養(yǎng)體積為培養(yǎng)裝置總體積的8％～40％，進行動態(tài)懸浮培養(yǎng)：

每天取樣計數(shù)；

計數(shù)后計算細胞密度并根據(jù)細胞密度補加含有500IU/ml IL-2的完全RPMI1640培養(yǎng)基，將細胞密度重新調(diào)整至1～20×10⁵cells/ml；

連續(xù)培養(yǎng)至第14天，即可獲得細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞；其中，

步驟(2)所述的細胞因子組合為：

IFN-γ(γ型干擾素)1000IU/mL，在接種時添加；

anti-CD3mAb(抗CD3單克隆抗體)50ng/mL，在接種24小時后添加；

IL-2(白細胞介素2)500IU/mL，在接種24小時后及后續(xù)培養(yǎng)過程中每天添加；

PHA(植物凝集素)500ng/mL，在接種24小時后添加；

IL-1α(白細胞介素1α)100IU/mL，在接種24小時后添加。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，步驟(3)所述的培養(yǎng)裝置為搖瓶或方瓶的一種。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)裝置裝液量的范圍為培養(yǎng)裝置總體積的8％～40％。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法，其特征在于，在培養(yǎng)過程中補加培養(yǎng)基使得培養(yǎng)體系體積增加，當培養(yǎng)體積超過培養(yǎng)裝置總體積的40％時，將細胞培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移至更大體積的培養(yǎng)裝置，裝液量仍控制在培養(yǎng)裝置總體積的8％～40％的范圍內(nèi)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞因子誘導(dǎo)殺傷細胞動態(tài)懸浮培養(yǎng)的方法,其特征在于，隨著培養(yǎng)體積的增加，將搖床的轉(zhuǎn)速從50rpm逐步調(diào)整到130rpm。