[發(fā)明專利]一種基于GST?PullDown以及質(zhì)譜分析技術(shù)尋找如皋黃雞基因互作蛋白的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611215943.1
• 申請日: 2016-12-26
• 公開（公告）號: CN107043764A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李碧春;左其生;王穎潔;張亞妮;湯貝貝;李東;紀(jì)艷芹;連超;王飛;路鎮(zhèn)宇
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;G01N27/62
• 代理公司: 揚州蘇中專利事務(wù)所(普通合伙)32222
• 代理人: 許必元

1.一種基于GST-Pull Down以及質(zhì)譜分析技術(shù)尋找如皋黃雞基因互作蛋白的方法，其特征是，所述方法包括以下步驟：

(1)目的基因克隆以及原核表達載體構(gòu)建

根據(jù)如皋黃雞目的基因的NCBI基因登陸號尋找目的基因的CDS全序列，設(shè)計特異性引物并引入EcoR I和Hind III酶切位點，酶切位點根據(jù)目的基因的基本信息進行確定，通過PCR方法克隆目的基因CDS全序列，克隆產(chǎn)物純化后經(jīng)測序驗證，用于后續(xù)試驗；

(2)Pet-49(b)-GST-目的基因的原核融合表達載體構(gòu)建

將步驟(1)測序正確的克隆產(chǎn)物和Pet-49(b)原核表達載體分別通過EcoR I和Hind III進行雙酶切，酶切3h后進行純化并連接，連接16h后轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽性細菌克隆并提取質(zhì)粒，通過雙酶切和測序?qū)?gòu)建的原核融合表達重組質(zhì)粒進行鑒定，獲取構(gòu)建成功的Pet-49(b)-GST-目的基因質(zhì)粒；

(3)Pet-49(b)-GST-目的基因進行原核表達

將步驟(2)獲取構(gòu)建成功的Pet-49(b)-GST-目的基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)化原核達菌種BL，同時利用異丙基硫代半乳糖苷IPTG對BL菌種進行誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3h后提取菌液蛋白，通過SDS-PAGE檢測蛋白的表達情況，同時利用GST和目的基因基因抗體檢測目的蛋白的表達情況；

(4)對蛋白進行大量表達和破菌檢測；

(5)明確蛋白的表達位置后對表達的蛋白進行純化和濃縮并進行GST-Pull Down試驗；

(6)GST-Pull Down后的蛋白進行蛋白質(zhì)還原烷基化和膠內(nèi)酶解并通過LC-MS/MS鑒定獲取目的基因的互作蛋白的序列。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于GST-Pull Down以及質(zhì)譜分析尋找如皋黃雞基因互作蛋白的方法，其特征是，所述步驟(4)蛋白大量表達及破菌檢測具體過程為：

以300ml為例，取3mLLB液體培養(yǎng)基，加入抗生素；取菌液蛋白室溫解凍，充分混勻后，取3μL接種入所述LB培養(yǎng)基中；置于搖床37℃，200rpm，過夜搖菌；將3mL過夜生長的菌液全部接種于300mL含抗生素的LB培養(yǎng)基，37℃，200rpm生長，降溫到所需求的誘導(dǎo)溫度后加入異丙基硫代半乳糖苷IPTG進行誘導(dǎo)；4小時后將菌液倒入50mL離心管中，4℃8000rpm離心3min，棄上清；菌體加25mL緩沖液重懸，裝入25mL燒杯內(nèi)；加溶菌酶混勻，V_溶菌酶：V_菌液＝1:200；冰上30min；冰上超聲，工作時間：3h；間隙時間：4s；工作次數(shù)：99；功率不超過200w；倒入離心管內(nèi)，4℃16000rpm離心30min；取樣品進行SDS-PAGE檢測；剩余上清及沉淀至于0-7℃?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于GST-Pull Down以及質(zhì)譜分析尋找如皋黃雞基因互作蛋白的方法，其特征是，所述步驟(5)對表達的蛋白進行純化和濃縮上清蛋白純化具體過程為：

將GST瓊脂糖凝膠裝入層析柱，用10倍柱床體積的Buffer沖洗；將步驟(4)檢測的上清樣品加到層析柱中，流速控制在0.5mL/min；層析用10倍柱床體積的Buffer沖洗除雜，流速控制在1mL/min；用10倍柱床體積的GSH緩沖洗脫，流速控制在1mL/min，收集洗脫峰；SDS-PAGE跑膠檢測各組分；進行蛋白濃縮。