[發明專利]即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒

在審

• 申請號: 201611214324.0
• 申請日: 2017-04-07
• 公開（公告）號: CN106834438A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 劉淑園;陳華云;肖湘文
• 申請（專利權）人: 廣州和實生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其反應液組成如下：

Tris-HCl（pH8.3） 50mM

KCl 60mM

二硫蘇糖醇2mM

甜菜堿1M

海藻糖5.5%

PEG 5.5%

BSA 0.1mg/mL

反應酶系和啟動液各適量。

2.根據權利要求1所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其啟動液組成如下：

氯化鎂10mM。

3.根據權利要求1所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其反應酶系組成如下：

dNTPs 200uM

聚合酶Bsu 50U

單鏈結合蛋白262ng/ul

重組酶（E.coli RecT） 360ng/ul

上游引物200nM

下游引物200nM

熒光探針（如果需要）30nM

重組酶為不依賴于能量分子的重組酶。

4.根據權利要求3所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，所采用的上游引物跟下游引物，其特征在于上游引物序列為：CAACATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCC；

下游引物序列為：TGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGAC。

5.根據權利要求1所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，基于恒溫擴增反應試劑配合一種雙色熒光標記的探針，可以進行即時熒光檢測，所采用的熒光探針，其特征在于熒光探針序列為：CGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAG(FAM-dt)A(dSpacer)A(BHQ-dT)ACAAGGATTGGATTACA。

6.根據權利要求1所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其特征在于：Tris-緩沖液的pH為7～9，優選pH為8.3。

7.根據權利要求3所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其特征在于：重組酶選自E.coli RecT蛋白；λ噬菌體β蛋白；啤酒酵母SepΙ/STPβ；啤酒酵母DPA蛋白；啤酒酵母STPα蛋白；粟酒裂殖酵母p¹⁴⁰/Exo∥蛋白以及RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。

8.根據權利要求1-6所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其特征在于：恒溫擴增的溫度為37～42℃，優選擴增溫度為37℃。

9.根據權利要求1-3所述的一種即時檢測單核增生性李斯特菌的恒溫檢測方法及其試劑盒，其特征在于用氯化鎂作為反應的啟動液，濃度為5mM~20mM，優選濃度為10mM。