[發明專利]人源分子伴侶樣蛋白及其表達純化、晶體結構和應用

有效

• 申請號: 201611212468.2
• 申請日: 2016-12-25
• 公開（公告）號: CN106589104B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發明（設計）人: 李繼喜;段樹燕;紀銳;陳子珺
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C12N15/70;C07K1/22;C07K1/16;C12N9/00;C12N9/10;C12R1/19
• 代理公司: 上海正旦專利代理有限公司 31200
• 代理人: 陸飛;陸尤

本發明屬于生物技術領域，具體為一種人源分子伴侶樣蛋白及其表達純化、晶體結構和應用。本發明的人源分子伴侶樣蛋白Archease由179個氨基酸組成，分子量為20.7kDa；在大腸桿菌表達菌株Bl21(DE3)plus中可溶性表達且表達量較高。動態光散射表明Archease在結合RNA剪切連接酶輔因子GTP后粒徑變大，與其功能發揮緊密相關。Archease的晶體結構分辨率為1.96?。該結構由7個β折疊和4個α螺旋組成。Archease在輔助同一操縱子蛋白如RNA剪切連接酶、甲基轉移酶發揮作用方面起到了重要的催化調節作用，是內質網應激蛋白XBP1 mRNA的成熟加工過程中所必需。解析Archease的三維晶體結構有助于闡明其作用機理，從而更好的發揮并拓寬其作用范圍。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種人源分子伴侶樣蛋白Archease及其表達純化、晶體結構、動態光散射結果及其在輔助多種蛋白發揮作用方面的重要作用。

背景技術

Archease從古生物到人都高度保守，具體作用底物仍未被發現，人源Archease能夠催化RNA剪切連接酶RTCB發揮作用，在果蠅中缺失Archease會阻礙視神經軸突的再生，嗜熱古菌Archease能催化甲基轉移酶發揮作用。在Archease存在的情況下可以明顯加速RNA剪切連接酶及甲基轉移酶發揮作用。根據已有的報道Archease對與其同一操縱子的蛋白起到了催化劑的作用，而與Archease處于同一操縱子的許多蛋白對于生化反應的進行具有重要的調控作用，內質網應激蛋白XBP1mRNA的成熟加工過程中Archease的輔助作用是必需的。Archease輔助蛋白均在免疫過程中發揮了重要作用。因此通過結構生物學方法獲得Archease的晶體結構及利用動態光散射結果表明在結合輔因子后粒徑的變化對于找到其作用底物，闡明其作用機理從而進一步拓寬其應用具有重要的指導作用。

發明內容

本發明的目的在于提出人源分子伴侶樣蛋白Archease及其表達純化、晶體結構、動態光散射結果及其在輔助多種蛋白發揮作用方面的應用。

本發明涉及對人源Archease進行密碼子優化，以獲得在大腸桿菌中以可溶性形式表達的重組蛋白；對重組蛋白進行純化、結晶；獲得人源Archease第20位到第179位氨基酸的三維晶體結構，及其應用。

本發明首先對人源Archease進行了密碼子優化，得到密碼子優化的人源Archease。具體將其全長基因克隆在pet28b+表達載體上，選用Nco1及Xho1酶切位點，為避免移碼突變的產生，在起始密碼子ATG后的添加以鳥嘌呤開頭的丙氨酸，在本發明描述過程中其他氨基酸順序依次順延。同時保留載體上C-端的6XHis，用于后續純化工作。

本發明涉及的人源Archease,含179個氨基酸，分子量為20.7kDa，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。

本發明優先選擇使用大腸桿菌的原核細胞表達系統(但不排除其他的表達系統，如在其它細菌或者其他的真核生物細胞中進行表達)；對以上所述蛋白以融合蛋白的方式進行表達，優先選擇了His標簽得到了可溶性表達(但不排除其它標簽，如MBP或GST等標簽也有可溶性表達)。

本發明還提供表達和純化人源Archease的方法，該方法包括：構建了人源Archease重組載體，用該載體轉化大腸桿菌，從而表達帶有標簽的重組蛋白Archease，將上述獲得的蛋白通過特異性的與所述特異標簽識別的方法(優選Ni親和層析(分離原理為：低咪唑濃度緩沖液進行上樣，高咪唑濃度緩沖液進行洗脫))，分離出目的蛋白，經凝膠過濾層析，得到高純度的重組蛋白Archease。