[發明專利]多肽探針、包含該探針的試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201611209386.2
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106632689B
• 公開（公告）日: 2020-04-14
• 發明（設計）人: 楊用;梁巖
• 申請（專利權）人: 中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12Q1/37;C12Q1/02
• 代理公司: 深圳市科進知識產權代理事務所(普通合伙) 44316
• 代理人: 曹衛良

本發明涉及生物醫療領域，具體而言，涉及一種多肽探針、包含該探針的試劑盒及其應用。所述多肽探針選自下列物質及其二聚體的組合物：X¹?Y¹?CC；其中，X¹為具有二聚化能力的多肽；Y¹選自待檢測酶的酶切位點序列。該探針充分利用雙砷染料?四半胱氨酸標簽復合物的穩定性和量子產率極度依賴于四半胱氨酸標簽空間構象這一特性，進而發展了一種簡單、靈敏測定酶活性的方法。

技術領域

本發明涉及生物醫療領域，具體而言，涉及一種多肽探針、包含該探針的試劑盒及其應用。

背景技術

細胞凋亡是一種由基因控制的細胞主動死亡過程，對多細胞生物個體的發育、正常細胞更新、組織保持正常結構與功能有著積極而重要的意義，異常細胞凋亡則會導致腫瘤、神經退行性疾病等疾病的發生。細胞凋亡的實施是由一系列半胱氨酸蛋白酶所引發的級聯反應來實現的(Cold Spring Harb.Perspect.Biol.,2013,5(4):a008656)，在半胱氨酸蛋白酶家族中，半胱氨酸蛋白酶-3屬于效應型凋亡酶，激活的半胱氨酸蛋白酶-3可降解一系列底物，包括凋亡抑制物、細胞外基質與骨架蛋白以及DNA修復相關因子，使細胞生化以及形態學發生改變，導致細胞凋亡(Oncogene,2008,27(48):6194-6206)。半胱氨酸蛋白酶-3是細胞凋亡執行階段的關鍵蛋白酶，因此可以通過測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性來測定細胞凋亡過程。

雙砷染料-四半胱氨酸標簽體系是一種具有廣闊應用前景的活細胞蛋白熒光標記方法(Science,1998,281(5374):269-272)。在該系統中，四半胱氨酸標簽是一個包含四個半胱氨酸殘基的六肽或十二肽(Nat.biotechnol.,2005,23(10):1308-1314)，半胱氨酸殘基兩兩結合在一起，形成半胱氨酸-半胱氨酸二聯子，這兩個二聯子被脯氨酸-甘氨酸二聯子分隔開來。四半胱氨酸標簽對雙砷染料具有較高的特異性和親和力。雙砷染料在被1,2-乙二硫醇螯合的情況下不發熒光，但是一旦與四半胱氨酸標簽結合就會發出很強的熒光。除了以線性方式存在外，四半胱氨酸標簽中的兩個半胱氨酸-半胱氨酸二聯子還可以被分離開來，但是它們在空間上必須相臨近(Nat.Chem.Biol.,2007,3(12):779-784)。在該標記系統中，四半胱氨酸標簽的空間構象會對所形成雙砷染料-四半胱氨酸標簽復合物的穩定性和量子產率產生極大的影響(J.Am.Chem.Soc.,2002,124(21):6063-6076)。

半胱氨酸蛋白酶-3通常以無活性的酶原存在細胞中，需要被上游的激活型凋亡酶切割而得以活化。激活的半胱氨酸蛋白酶-3可以特異性切割天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸四肽序列，根據這一特性，一系列基于天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸的探針被開發出來用于測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性，對應的方法有熒光檢測法、電化學法、比色法、表面等離子體共振法、生物發光法、電致化學發光法。隨著納米技術的發展，一些基于納米材料的多肽探針如量子點復合多肽探針、納米金復合多肽探針、石墨烯復合多肽探針也被開發出來用于測定半胱氨酸蛋白酶-3的活性(Chem.rev.,2015,115(22):12546-12629)。此外，一些基于熒光共振能量轉移反應的蛋白探針以及熒光開關(Nat.Commun.,2013；，4:2157)也被開發出來用于測定細胞內半胱氨酸蛋白酶-3的活性。在這些方法中，熒光標記會在一定程度上降低半胱氨酸蛋白酶-3對底物的切割效率，制備納米傳感器則使得檢測過程變得復雜和低效。因此迫切需要發展簡單、靈敏、高效的方法來測定細胞內半胱氨酸蛋白酶-3活性從而來檢測細胞凋亡過程。此外，本領域在檢測其它酶的活性時也或多或少的存在上述問題，且缺乏一種高效的可針對各種酶的活性進行檢測的技術。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

在本發明中，我們充分利用雙砷染料-四半胱氨酸標簽復合物的穩定性和量子產率極度依賴于四半胱氨酸標簽空間構象這一特性，設計了一種新型無標記多肽分子探針，進而發展了一種簡單、靈敏測定酶活性的方法。