[發明專利]使用重組嗜鹽甲烷氧化菌生產異戊二烯的方法

有效

• 申請號: 201611208648.3
• 申請日: 2016-12-23
• 公開（公告）號: CN106995792B
• 公開（公告）日: 2020-10-16
• 發明（設計）人: 宋在亮;趙光國;李氣成;羅蓮花;馬里納·卡爾宇治納雅
• 申請（專利權）人: SK新技術株式會社;圣地亞哥州立大學研究基金會
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P5/02;C12R1/26;C12R1/01
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 李新娜;張晶

本發明涉及具有生產異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌以及使用其生產異戊二烯的方法，更具體地涉及具有生產異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌和使用此重組甲烷氧化菌生產異戊二烯的方法，其中該重組甲烷氧化菌中引入了編碼與甘薯(Ipomoea batatas)異戊二烯合酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的異戊二烯合酶的基因。使用本發明的重組甲烷氧化菌能夠利用獲取自廢棄物如天然氣、生物質、城市垃圾等的甲烷氣體或甲醇作為碳源以高產率生產異戊二烯。

技術領域

本發明涉及具有生產異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌以及使用其生產異戊二烯的方法，更具體地涉及其中引入了編碼與甘薯(Ipomoea batatas)異戊二烯合酶的氨基酸序列具有至少70％同源性的異戊二烯合酶的基因并具有生產異戊二烯能力的重組甲烷氧化菌以及使用此重組甲烷氧化菌生產異戊二烯的方法。

背景技術

類異戊二烯是可用于藥物、營養品、香料、芳香劑、香水和橡膠產品的異戊二烯聚合物。異戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是不溶于水但可溶于醇的揮發性烴。可以通過從石油C5裂解級分中直接分離得到或通過C5異烷烴或異烯烴的脫水得到商業上可行的量的異戊二烯(Weissermel和Arpe,Industrial Organic Chemistry(工業有機化學),第四版,Wiley-VCH,117-122頁,2003)，并且C5骨架也可以由較小的亞單元合成。

異戊二烯的生物合成通過兩種不同的代謝途徑發生(Julsing等，Appl MicrobiolBiotechnol,75:1377-1384,2007)。在真核生物和原生生物中，異戊二烯經由甲羥戊酸(MVA)途徑合成，而在一些細菌和高等植物中，異戊二烯經由甲基赤蘚醇磷酸(methylerythritol phosphate，MEP)途徑合成。植物散發異戊二烯依賴于光和溫度，并隨著葉的發育而增加。已在白楊(Aspen)樹中鑒定出異戊二烯合酶，即異戊二烯生產酶(Silver和Fall,Plant Physiol,97:1588-1591,1991；以及Silver和Fall,J Biol Chem,270:13010-13016,1995)，并認為異戊二烯合酶負責全部葉子中異戊二烯的體內生產。還報道了異戊二烯的細菌生產(Kuzma等,Curr Microbiol,30:97-103,1995；Wilkins,Chemosphere,32:1427-1434,1996)，并且生產量隨細菌生長階段和培養基中營養物的含量而變化(美國專利第5,849,970號；Wagner等，J Bacteriol,181:4700-4703,1999)。

然而，由現有技術中的細菌系統獲得的異戊二烯的水平不足以用于商業用途。因此，需要一種有效的、大規模的、細菌生產異戊二烯的方法來提供用于制造類異戊二烯的原料。

另一方面，在C1化合物中，甲烷氣體由天然氣和合成氣低成本地制造，其中合成氣為通過焚燒諸如生物質、城市垃圾等的廢棄物得到的一氧化碳、二氧化碳和氫的混合氣體。天然氣作為下一代能源引起人們的關注，因為它大量存在于化石資源中并產生相對少量的CO₂。因此，正在發生從常規石油向天然氣的轉變。

甲烷氧化菌是采用分子中不具有C-C鍵的碳化合物(如甲烷、甲醇、甲胺、二甲胺、三甲胺等)作為唯一碳源或能源的同化C1化合物的微生物的總稱。稱為甲烷氧化菌(methanotroph)、甲烷氧化細菌(methane-oxidizing bacteria)、甲醇同化菌(methanolassimilating bacteria)、甲醇同化酵母、甲醇同化微生物的任何微生物均屬于甲基營養菌(methylotrophs)。甲基營養菌的主要代謝反應是在將甲醇轉化為甲醛之后再將甲醛轉化為具有C-C鍵的有機物的反應。

作為使用甲烷氧化菌生產異戊二烯的方法，報道了幾種包含從外部引入異戊二烯合酶的方法。然而，當將外源基因異戊二烯合酶引入甲烷氧化菌中時，存在甲烷氧化菌不具有足夠的生產異戊二烯能力的缺點，因此異戊二烯產量低(US2015-0225743；KR2015-0100666；WO2014-138419；WO2014-089436)。