[發明專利]啟動子、重組間質干細胞及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201611200969.9
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN107034217A
• 公開（公告）日: 2017-08-11
• 發明（設計）人: 閆立;連祺周
• 申請（專利權）人: 中基恒潤國際控股有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/28;A61P29/00;A61P19/08
• 代理公司: 深圳市智享知識產權代理有限公司44361
• 代理人: 藺顯俊

1.一種啟動子，其特征在于：所述啟動子的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一種重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：包括：提供TNF α抗體基因和權利要求1中所述的啟動子，構建得到慢病毒表達質粒；其中，所述TNF α抗體基因的序列如SEQ ID NO:1所示；

將所述慢病毒表達質粒進行慢病毒包裝，獲得病毒液；

在所述病毒液中感染間充質干細胞，得到所需的重組間質干細胞。

3.如權利要求2中所述重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：所述慢病毒表達質粒的構建包括：

步驟S11：將所述TNF α抗體基因和所述啟動子克隆進穿梭質粒pGFP，獲得穿梭質粒TNF α-GFP；

步驟S12：以所述穿梭質粒TNF α-GFP作為載體，加入所述TNF α抗體基因得到TNF α-AB質粒載體；

步驟S13：轉化所述TNF α-AB質粒載體并進行質粒抽提得到所述慢病毒表達質粒。

4.如權利要求3中所述重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：所述TNF α抗體基因通過采用核酸內切酶Xho1和核酸內切酶Xba1對所述穿梭質粒TNF α-GFP進行雙酶切得到。

5.如權利要求4中所述重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：所述雙酶切的時間為3-24h。

6.如權利要求3中所述重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：所述步驟S12為利用TNF α抗體基因以及穿梭質粒TNF α-GFP進行連接反應，獲得TNF α-AB質粒載體；所述連接反應的反應體系中所述穿梭質粒TNF α-GFP的濃度為2-3ng/μL，所述TNF α抗體基因摩爾數為所述穿梭質粒TNF α-GFP摩爾數的2-4倍。

7.如權利要求6中所述重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：所述步驟S12還包括在反應體系中加入DNA連接酶和連接緩沖液；所述反應體系中DNA連接酶的體積百分比為2-3％，連接緩沖液的體積百分比為8-12％。

8.如權利要求3中所述重組間質干細胞的制備方法，其特征在于：轉化所述TNF α-AB質粒載體具體包括以下步驟：將所述TNF α-AB質粒載體加入大腸桿菌DH5α感受態細胞中，混合均勻后得到混合溶液；將該混合溶液冰浴20-50min，經40-45℃熱休克作用30-90s后再冰浴1-4min；然后將混合溶液置于培養基中培養，得到含有所述慢病毒表達質粒的培養液。

9.一種重組間質干細胞，其特征在于：整合有啟動子和TNF α抗體基因；所述啟動子的序列如SEQ ID NO:2所示，所述TNF α抗體基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

10.一種重組間質干細胞的應用，其特征在于：將權利要求9中所述的重組間質干細胞用于制備治療骨關節炎的藥物。