[發明專利]一種蕨類孢子滅菌及接種方法

在審

• 申請號: 201611200707.2
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106613977A
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 何俊;李村富;孟靜;楊俊波;李德銖
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明植物研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 昆明協立知識產權代理事務所(普通合伙)53108
• 代理人: 旃習涵

1.一種蕨類孢子的消毒及接種方法，其特征在于該方法先收集蕨類孢子，把蕨類孢子葉裝入硫酸紙袋中，標記代號后置于通風干燥處，待孢子自由脫落；把DNA純化柱，規格：吸附柱1ml、收集管2ml、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；用對折過的硫酸紙收集脫落在紙袋中的孢子，簡單的去除雜質碎葉、環帶、鱗毛后沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，并做好標記，放置于離心管架上；在無菌條件下，加入600μl 75％乙醇，倒立純化柱1-2次，之后200-1200rpm離心20s；從加乙醇開始，直到完成離心，整個操作過程控制在25-35s內；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl無菌水，反復吸打溶液使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，重復1-2次，洗脫乙醇；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s；倒棄收集管中廢液，在無菌條件下加入600μl無菌水，反復吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，此操作重復3-4次，使消毒液徹底洗脫；再向離心之后的吸附柱中添加600μl無菌水，反復吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養基上，實現接種。

2.一種蕨類孢子的消毒及接種方法，其特征在于該方法包括下述步驟：

步驟1：收集孢子，把蕨類孢子葉片裝入硫酸紙袋中，標記代號后置于通風干燥處，等孢子自由脫落；

步驟2：把DNA純化柱，規格：吸附柱1ml，收集管2ml、1ml槍頭、純凈水在121℃高溫滅菌20-30min備用；

步驟3：在對折過的硫酸紙片上鋪一層擦鏡紙，把自由脫落在硫酸紙袋中的孢子倒在擦鏡紙上，輕微抖動擦鏡紙進行簡單的過濾，孢子可以通過擦鏡紙的孔隙，而碎葉、環帶、鱗毛等雜質會留在擦鏡紙上達到簡單過濾的目的，然后把過濾后的孢子沿著折痕倒入已滅菌的吸附柱中，蓋好蓋子，放入收集管中，做好標記，放置于離心管架上；

步驟4：在無菌操作臺上，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 75％乙醇，蓋好蓋子消毒30s，期間倒立純化柱1-2次，在孢子消毒的同時，吸附柱內部也得到滅菌，然后200-1200rpm離心20s，加乙醇，倒立純化柱，離心完成盡量控制在30s內；

步驟5：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液。吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上。在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打溶液充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s，重復1-2次；

步驟6：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架，在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，用1ml移液槍加入600μl 0.1-0.2％氯化汞滅菌2-4min或2％次氯酸鈉消毒6-8min，反復吸打溶液使孢子懸濁充分滅菌，然后200-1200rpm離心20s；

步驟7：取出吸附柱，倒棄收集管中廢液，吸附柱放回收集管中，放置于離心管架上，在無菌操作臺中，打開吸附柱蓋，此時吸附柱及孢子已經過乙醇，氯化汞或次氯酸鈉消毒處于無菌狀態，用1ml移液槍加入600μl無菌水，反復吸打使孢子懸濁，充分漂洗孢子，然后200-1200rpm離心20s；

步驟8：重復步驟7，3-4次；

步驟9：用1ml移液槍取600μl無菌水加入吸附柱中，反復吸打使之呈孢子懸濁液，吸取100μl孢子懸濁液接種到培養基上；

步驟10：把培養物移到溫度25±2℃暗培養3-5天，再移至光照條件培養2周后孢子萌發。

3.權利要求1或2所述的一種蕨類孢子的消毒及接種方法在蕨類離體保存過程中的應用。