[發明專利]一種快速診斷脂蛋白相關磷脂酶A2試劑盒及其使用方法

有效

• 申請號: 201611200276.X
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106771147B
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 陳立國;鄒偉權;張亞麗;李慶祥;母潤紅;王濤;蘇焱
• 申請（專利權）人: 廣州華弘生物科技有限公司
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/573
• 代理公司: 廣州勝沃園專利代理有限公司 44416
• 代理人: 張帥

1.一種快速檢測脂蛋白相關磷脂酶A2試劑盒的使用方法，該試劑盒包含：標準品和質控品、脂質體復合物、磁性分離試劑、分析緩沖液及清洗液；

所述的脂質體復合物的內部包被有三聯吡啶釕的N-羥基琥珀酰亞胺酯，表面通過鏈霉親和素-生物素的相互作用連接有抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體；

所述的磁性分離試劑為以含有氨基末端的磁微粒為載體，通過鏈霉親和素-生物素的相互作用連接有抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體；

所述的脂質體復合物的制備包括以下步驟：

（1）取磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000，混合，溶于5mL的氯仿中，超聲處理5min，然后在28℃，0.1MPa的條件下旋轉蒸發，除去氯仿，靜置30min，然后加入1mL 三聯吡啶釕的N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液，在60℃水浴中振蕩反應1h，得脂質體懸浮液，將脂質體懸浮液超聲處理3 min，然后使用注射器式濾器調整脂質體的粒徑至90~100nm，得到內部包裹有三聯吡啶釕的N-羥基琥珀酰亞胺酯的脂質體，其中，磷脂酰膽堿、膽固醇、二硬脂酰磷脂酰甘油、生物素化的二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000的摩爾比為10:8:2:0.6；三聯吡啶釕的N-羥基琥珀酰亞胺酯溶液為溶于二甲基甲酰胺中質量濃度為3%的溶液；

（2）取50μL濃度為1x10^-10 mol/L的鏈霉親和素與500μL步驟（1）制得的脂質體，混合，在室溫下孵育1h，制得表面包被有鏈霉親和素的脂質體；

（3）往步驟（2）制得的脂質體中加入生物素化合的抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體，所述抗體在體系中的終濃度為10μg/mL，孵育12 h，加入2%(w/v)BSA，繼續孵育12 h，以阻斷脂質體表面上的非特異性位點，將得到的脂質體復合物置于4℃保存，即得脂質體復合物；

所述的步驟（3）中生物素化合的抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體的制備包括以下步驟：取抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體溶于pH為7.2的PBS緩沖液中，制成濃度為1.0~2.0mg/mL的溶液；另取EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶于pH為7.2的PBS 緩沖液中，制成濃度為10~20mM的溶液；然后取1mL濃度為1.0~2.0mg/mL 的抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體溶液與25μL的濃度為10~20mM的EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotin溶液混合，置于室溫中反應1~2h，再使用PD-10的凝膠過濾器進行過濾，即得生物素化合的抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體；

所述的磁性分離試劑的制備包括以下步驟：

取1mL生物素化合的抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體與200μg的鏈霉親和素包被的磁微粒混合，在室溫條件下，100r/min 反應1~2h，反應結束后，磁性分離，去上清，加入pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復洗滌多次，然后加入1mL濃度為0.2~0.4mM的D-生物素水溶液，室溫下反應30min，以充分阻斷未與生物素化合的抗脂蛋白相關磷脂酶A2抗體結合的鏈霉親和素位點，反應結束后，磁性分離，去上清，用pH為7.4的Tris-HCl緩沖液反復洗滌多次以除去多余的D-生物素，加入含2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐溫-20、pH為7.2的 PBS溶液復溶，即得磁性分離試劑；

所述的鏈霉親和素包被的磁微粒的制備包括以下步驟：

（1）取1mg氨基末端磁性微粒，加入400μL甲醇反復清洗，磁性分離，棄上清，加入400μL的交聯劑溶液，置于恒溫振蕩器，反應10h，然后依次用甲醇和超純水將反應后的磁性微粒反復清洗多次，保存于水中備用；其中，交聯劑溶液的制備包括以下步驟：取50mg的碳化二亞胺和50mg的N-羥基琥珀酰亞胺混合，加入100ml的PBS緩沖溶液溶解，即得；

（2）將步驟（1）制得的磁性微粒用500μL PBS緩沖溶液平衡30~60min，加入200 μg 鏈霉親和素，置于恒溫振蕩器中反應1~2h，磁性分離去上清，用含1mmol/L EDTA的PBS緩沖溶液反復清洗，制得鏈霉親和素包被的磁性微粒；

所述的標準品的制備包括以下步驟：

使用含0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、2% (w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐溫-20的溶液將脂蛋白相關磷脂酶A2抗原配制成濃度分別為 0，50，100，250，500，1000ng/ml 的標準液，即得；

所述的質控品的制備包括以下步驟：使用含0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、2%(w/v) BSA、0.1% (v/v) 吐溫-20的溶液將脂蛋白相關磷脂酶A2抗原配制成濃度分別為300，700ng/ml 的溶液，即得；

所述的分析緩沖液的組成為：0.1mol/L三丙胺、0.1mol/L磷酸二氫鉀、0.1mol/L氯化鈉、0.1% (v/v) 吐溫-20、1% (v/v) Triton X-100，pH為7.0~7.2；

所述的清洗液為含0.1% (v/v) 吐溫-20、0.1mol/L氯化鈉，且濃度為0.05mol/L、pH為7.2的磷酸鹽緩沖溶液；

所述試劑盒的使用方法包括以下步驟：

（1）使用含2%(w/v) BSA的PBS緩沖液將脂質體復合物按1:5的比例進行稀釋；

（2）取25μL稀釋后的脂質體復合物、25μL磁性分離試劑、50μL待測樣本或脂蛋白相關磷脂酶A2標準品，混合，在室溫條件下渦旋1h，充分反應，形成磁性微粒-抗原-脂質體復合物，將反應液吸入電化學反應池中，所述的磁性微粒-抗原-脂質體復合物通過磁性吸附于電極表面，加入100μL清洗液輕輕潤洗電極表面3次，去清洗液，然后加入500μL反應緩沖液，使脂質體內的三聯吡啶釕的N-羥基琥珀酰亞胺酯溶出，溶出的三聯吡啶釕的N-羥基琥珀酰亞胺酯上的酰基與鏈霉親和素上的氨基發生偶聯反應，通過鏈霉親和素和生物素的相互作用，與抗體結合，電化學工作站通電，啟動ECL反應，通過光電倍增管收集電化學發光信號；

（3）測定梯度濃度的脂蛋白相關磷脂酶A2標準液的發光強度變化值，根據發光強度變化值對數與相應的濃度對數繪制反應曲線，計算待測樣本中脂蛋白相關磷脂酶A2的濃度。