[發明專利]一種全基因組高效基因區富集測序方法

有效

• 申請號: 201611199575.6
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106636065B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 夏志強;鄒枚伶;王文泉;張圣奎;馮素彬
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12Q1/6869;C40B50/06
• 代理公司: 廣東深宏盾律師事務所 44364
• 代理人: 譚宗成

本發明提供一種全基因組高效基因區富集測序方法，包括步驟：A）樣品進行全基因組DNA的提取；B）全基因組mRNA的提取；C）全基因組mRNA反轉錄為cDNA；D）全基因組cDNA的碎片化；E）分批回收短序列片段；F）進行單酶切；G）酶切片段末端可增加barcode接頭連接；H）DNA酶切片段裝入環形質粒中，構建DNA文庫；I）根據質粒兩端序列分別設計兩對引物為右引物；J）對H中構建好的DNA文庫進行PCR擴增；K）擴增片段進行高通量測序，獲得基因區富集序列。本發明對于真核生物的復雜基因組，通過本方法構建的文庫，可以極大的降低測序成本，同時得到更有效的基因組基因區數據。

技術領域

本發明涉及基因組學、生物技術領域，及而言涉及將基因區富集測序、簡化重測序、重復序列去除為目的，一種全新的巧妙利用基因組自身基因序列，進行基因區序列的富集測序方案，進而降低測序成本、減少信息處理量，提供特殊基因區文庫。對后基因組時代與復雜基因組具有重要意義，應用將及其廣泛。

背景技術

1基因富集的方法

1.1 cDNA文庫(cDNA library)與轉錄組測序。1976年Hofstetter成功的構建了第一個cDNA文庫以來,構建cDNA文庫已成為研究功能基因組學的基本手段之一。cDNA文庫的構建是分子生物學領域的一項重要技術。cDNA是以mRNA 為模板，在逆轉錄酶的作用下，在體外被逆轉錄為cDNA第一鏈，再以cDNA為模板，由大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ合成第二鏈，得到雙鏈cDNA。由于組織或細胞的總RNA或mRNA中，含有該細胞的全部mRNA分子，因而被合成的cDNA 產物將是各種mRNA拷貝的群體。當它們與質粒重組后并轉化至宿主細胞中，將得到一系列克隆群體，每個克隆僅含有一種mRNA信息，所有克隆的總和則包含細胞內全部mRNA的信息，這種克隆群體則為cDNA文庫。目前,廣泛使用的方法是SMART技術。目前對于大多數物種而言,全基因組測序是不現實的, 為了快速、經濟地獲得基因序列、了解基因的功能以及基因組中基因數量等相關信息,構建cDNA文庫是一種有效、簡便且快速的可行方法。所以cDNA文庫的構建已成為當前分子生物學研究和基因工程操作的基礎。但是有了最新的測序技術，我們將不再需要構建克隆文庫，可以直接對cDNA片段進行測序。對RNA 進行測序一直以來都被認為是一種發現基因的有效方法，而且這種方法還被認為是對編碼基因以及非編碼基因進行注釋的金標準。與以前的方法相比，大規模平行RNA測序方法(massivelyparallel sequencing of RNA)極大增強了RNA測序技術的處理能力，使我們得以能夠對轉錄組進行測序。我們現在可以只需要花費幾天，僅用以往同類項目科研經費的很少一部分就能夠得到一個比較滿意的完整的細胞轉錄組。

1.2外顯子捕獲技術

外顯子捕獲測序和轉錄組測序都是針對基因組上轉錄區域進行測序，但是外顯子捕獲測序針對已有基因組信息的物種，而轉錄組分析既能針對已有基因組信息的物種，也能針對沒有基因組信息的新物種，因此，兩者的分析存在一定的差異：(1)分析的目標區域有所不同。外顯子捕獲測序只針對基因組上已知的編碼區，而轉錄組測序不僅針對基因組上已知的編碼區，還能夠檢測非編碼RNA等轉錄組的信息。(2)分析的手段所有不同。外顯子捕獲測序只需要把測序結果比對基因組，分析序列差異。轉錄組測序既可以把測序結果比對基因組，也可以進行從頭(de Novo)拼接。(3)得到的結果有所不同。外顯子捕獲測序可以得到序列變異的信息，而轉錄組測序不僅可以獲得已知序列的變異信息和新的轉錄本信息(針對從頭拼接)，還可以得到表達譜信息。除此以外，轉錄組測序還能夠分析mRNA的可變剪接，而外顯子捕獲測序的樣品來源是基因組，不能夠進行 mRNA的可變剪接分析，只能夠得到外顯子上的序列變化。