[發(fā)明專利]一種鑒定木薯塊根肉質顏色的分子標記方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611199010.8
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN106755405B
• 公開（公告）日: 2019-11-01
• 發(fā)明（設計）人: 嚴華兵;周慧文;謝向譽;曹升;尚小紅;陳新;陸柳英;曾文丹
• 申請（專利權）人: 廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858
• 代理公司: 重慶為信知識產權代理事務所(普通合伙) 50216
• 代理人: 劉旭章

1.一種鑒定木薯塊根肉質顏色的分子標記方法，其特征在于，由以下步驟組成：

(1)采用CTAB法從木薯葉片中提取木薯基因組DNA，根據PSY2基因的DNA序列，設計一對特異引物可以擴增包含SNP2位點的260bp核苷酸序列，然后用該特異引物對木薯基因組DNA進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；

(2)利用限制性內切酶AluI酶切步驟(1)得到的PCR擴增產物，獲得酶切產物；

(3)使用濃度為3.0％瓊脂糖凝膠對步驟(2)的酶切產物進行電泳分離，然后根據電泳結果進行木薯材料的塊根肉質顏色判定，塊根肉質顏色判定標準為：

若電泳后可見2條帶——194bp和66bp，或電泳后見1條帶——194bp，則該木薯材料的塊根肉質顏色為黃色；

若電泳后可見2條帶——172bp和66bp，或電泳后見1條帶——172bp，則該木薯材料的塊根肉質顏色為白色；

若是電泳后可見3條帶——194bp、172bp和66bp，或電泳后見2條帶——194bp和172bp，則該木薯材料的塊根肉質顏色為淺黃色；

在步驟(1)，所述特異引物核苷酸序列為：

上游引物：5’GCTTCACACATAACGCCAACA-3’；

下游引物：5’TGGCTGAAACAGATGTTCAAAGG-3’。

2.根據權利要求1所述的一種鑒定木薯塊根肉質顏色的分子標記方法，其特征在于：在步驟(1)，所述PCR擴增的反應體系為25μL，由下列成分組成：10×PCRbuffer2.5μL、2μL濃度為25mmol/L的MgCl₂、2μL濃度為2.5mmol/L的dNTPs、0.5μL濃度為10μmol/L的正向引物、0.5μL濃度為10μmol/L的反向引物、0.5μL濃度為5U/μL的Taq、1μL濃度為50ng/μL的模板DNA。

3.根據權利要求1所述的一種鑒定木薯塊根肉質顏色的分子標記方法，其特征在于：在步驟(1)，所述PCR擴增的條件為：先在94℃下預變性3min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，進行35個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃下保存。

4.根據權利要求1所述的一種鑒定木薯塊根肉質顏色的分子標記方法，其特征在于：在步驟(2)，所述酶切體系為15μL，其中包含：PCR產物10μL、10×Lbuffer1.5μL、限制性內切酶AluI3.0U，其余為ddH₂O。

5.根據權利要求1所述的一種鑒定木薯塊根肉質顏色的分子標記方法，其特征在于：在步驟(3)，所述電泳方法為：用3.0％瓊脂糖凝膠電檢測泳，緩沖液為0.5×TBE，上樣量為15μL，在5V/cm恒壓下電泳1.5h。