[發(fā)明專利]L-脯氨酸4-羥化酶

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201611198550.4
• 申請日: 2016-12-22
• 公開（公告）號: CN108220259B
• 公開（公告）日: 2021-05-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張翀;李梅;邢新會
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12P13/24
• 代理公司: 北京彩和律師事務(wù)所 11688
• 代理人: 閆桑田

本發(fā)明涉及一種L?脯氨酸4?羥化酶突變體，以及編碼其的DNA、具有該DNA的重組載體，以及生產(chǎn)反式?(2S,4R)?4?羥基?L?脯氨酸的方法。該L?脯氨酸4?羥化酶突變體的序列為在SEQ ID No.:3所示的序列中具有如下突變中的一種或多種：91位從組氨酸到谷氨酰胺的突變；228位從纈氨酸到苯丙氨酸的突變；89位從酪氨酸到苯丙氨酸的突變；228位從纈氨酸到丙氨酸的突變；54位從纈氨酸到丙氨酸的突變；53位從蘇氨酸到丙氨酸的突變；152位從亮氨酸到谷氨酰胺的突變；165位從天冬氨酸到谷氨酸的突變，以及第266位從苯丙氨酸到亮氨酸的突變；53位從蘇氨酸到丙氨酸的突變，以及第272位從纈氨酸到異亮氨酸的突變；5位從蘇氨酸到絲氨酸的突變，以及第171位從亮氨酸到谷氨酰胺的突變。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及L-脯氨酸4-羥化酶的幾種突變體。

背景技術(shù)

反式-(2S,4R)-4-羥基-L-脯氨酸(L-Hyp)存在于植物和動物中。在植物中和多糖小側(cè)鏈結(jié)合形成糖蛋白。在動物中前膠原的脯氨酸殘基羥化成羥脯氨酸。這些羥基化的殘基之間的氫鍵用于穩(wěn)定前膠原的三股螺旋。L-Hyp與脯氨酸一起從明膠水解物中分離出來。L-Hyp作為膠原的成分，是一種非必需氨基酸，并且在宜它霉素等次級代謝物中被發(fā)現(xiàn)。

L-Hyp有C-2和C-4兩個手性中心，是生產(chǎn)多功能吡咯烷環(huán)的原料。吡咯烷環(huán)的所有位置都可以發(fā)生替代。C-3位替代可以通過氧化成4-羥基或形成烯烴完成。C-5功能化通過這個位置的氧化反應(yīng)實現(xiàn)也有報道。C-2和C-4的轉(zhuǎn)化可以輕易實現(xiàn)導(dǎo)致所有4種可能的L-Hyp異構(gòu)體。L-Hyp脫羧也是形成手性4-羥基吡咯烷的簡單方法。L-Hyp可以產(chǎn)生大量手性分子，如谷氨酸類似物、紅藻氨酸、精氨酸類似物、碳青霉烯類，自然產(chǎn)物如網(wǎng)紋馬勃酸、bulgecins、ecinochandins或didemnins，以及全合成的哌啶和吡咯烷，苯(并)二氮、嘌呤霉素類似物、巴氯芬、喹諾酮類、naphthyridones等(參見REMUZON P 1996.Trans-4-Hydroxy.L-ProHne,a Useful and Versatile Chiral Starting Block.TETRAHEDRON[J],52(44):13803-13835)。

發(fā)明內(nèi)容

L-Hyp在工業(yè)上通過水解哺乳動物膠原生產(chǎn)。但這種方法收率低、造成環(huán)境污染，所以需要更加綠色環(huán)保的方法。因此微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-Hyp受到越來越多的關(guān)注。目前國際上通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)L-Hyp的主要方法是日本協(xié)和發(fā)酵工業(yè)株式會社采用的整細(xì)胞催化方法，用表達(dá)L-脯氨酸4-羥化酶(P4H)的重組大腸桿菌整細(xì)胞催化L-脯氨酸生產(chǎn)羥脯氨酸，2-酮戊二酸由葡萄糖分解代謝提供，最高產(chǎn)量是發(fā)酵100小時產(chǎn)生41g/LL-Hyp(參見TAKESHI SHIBASAKI H M,AKIO OZAKI 2000.Enzymatic production of trans-4-hydroxy-L-proline by regio-and stereospecific hydroxylation of L-proline.Biosci.Biotechnol.Biochem.[J],64(4):746-750.)。