[發明專利]一種檢測前列腺癌循環腫瘤細胞的檢測方法

在審

• 申請號: 201611189125.9
• 申請日: 2016-12-21
• 公開（公告）號: CN106596941A
• 公開（公告）日: 2017-04-26
• 發明（設計）人: 傅深;李萍;章青;陳昌岳;馬超;張祥林
• 申請（專利權）人: 上海市質子重離子醫院有限公司;上海美吉生物醫藥科技有限公司;上海美吉醫學檢驗有限公司
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N33/543;G01N1/28
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種檢測前列腺癌循環腫瘤細胞的檢測方法，其特征在于，具體步驟如下：

步驟一，采集外周血液樣本：取一只采血管，抽取前列腺癌患者的外周全血，如需寄送樣品在常溫放置并且在48小時內檢測；

步驟二，血細胞分離：將采血管配平后置于水平離心機中，離心機在常溫下離心5-8分鐘，然后小心吸取上清至細胞層；向采血管中加細胞清洗液并且上下顛倒混勻，另取一只離心管并且加淋巴細胞分離介質，將混勻后的細胞小心轉移到淋巴細胞分離介質上層，再加細胞清洗液，潤洗后加在上層，重復潤洗一次；將離心管放在離心機中，離心機在常溫狀態下離心4-8分鐘，離心后分為三層，底層紅色的為紅細胞，中間略帶白色的中間層主要是白細胞和CTC，上層是黃色的血漿，吸取紅細胞以上的全部液體，去除紅細胞層；將磁珠混合均勻，逐滴加磁珠，水平搖床在常溫下搖動15-22分鐘；取一只離心管，加淋巴分離介質，將含有磁珠的懸浮液轉移至分離介質上層，將離心管放在離心機中，離心機在常溫下離心5-10分鐘，再吸取底層分離介質及以上液體，用大磁力架吸附2-3分鐘；

步驟三，抗體染色：抗體在抗體稀釋液中配制，CD45-Alexa 594抗體和PSMA-Alexa 488抗體濃度均為1mg/ml，各自取CD45-Alexa 594抗體和PSMA-Alexa 488抗體1μl后加入抗體稀釋液198μl，然后步驟二中的細胞中加200 μL 的稀釋后抗體，避光常溫孵育20 分鐘，孵育后加細胞清洗液至14 mL, 離心機離心2-5分鐘，去除上清液至100 μl；

步驟四，細胞固定：細胞與固定液按照1:1的比例混合，吹打混勻細胞，均勻涂在載玻片上的方框內，在28-34攝氏度的烘箱中無風風干過夜；

步驟五，乙醇脫水：將玻片插入100%乙醇脫色缸內1-4分鐘，擦去玻片背面和邊緣的乙醇殘留，用吹風機的冷風吹干；

步驟六，探針孵育：加10ul的CEP8探針，蓋上蓋玻片并且在四周加封片膠封片，先在72-80攝氏度下預雜交8-12分鐘；然后在35-40攝氏度下雜交15-18小時；

步驟七，清洗：撕去封片膠，將玻片插入到裝有探針雜交沖液液的染色缸內，在染色缸中晃動1-2分鐘，鑷子平移推去蓋玻片，在探針雜交緩沖液中清洗1-2次，每次5分鐘；然后在探針清洗液中清洗2-4次，每次5分鐘；

步驟八，封片：采用封片劑進行封片，蓋上蓋玻片即可。

2.根據權利要求1所述的檢測前列腺癌循環腫瘤細胞的檢測方法，其特征在于，所述封片劑為4',6-二脒基-2-苯基吲哚和甘油的混合物。

3.根據權利要求1或2所述的檢測前列腺癌循環腫瘤細胞的檢測方法，其特征在于，所述磁珠采用CD45免疫磁珠。